IL-2与EB病毒LMP1融合基因重组卡介苗的构建与鉴定

发布时间：2020-06-11 16:07

【摘要】：目的本研究将LMP1与人IL-2基因融合后构建重组质粒,并将构建的重组质粒载体通过电转导入感受态卡介苗(BCG),获得能够稳定表达融合蛋白的重组BCG(rBCG),通过对构建的EB病毒阳性鼻咽癌动物模型肿瘤生长的抑制情况检测rBCG的免疫效果,为研发既能抗结核病又能对EB病毒阳性肿瘤产生免疫的双价疫苗奠定了基础。方法从EB病毒阳性的B95-8细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得cDNA,以此为模板扩增获得LMP1,以IL-2 pMalLP质粒为模板扩增获得IL-2,利用重叠PCR(overlap-PCR)将两段基因进行融合获得融合基因,将酶切后的融合基因与酶切的穿梭表达质粒pMV261进行连接,对获得的重组质粒进行酶切、PCR、测序鉴定,将鉴定正确的重组质粒通过电转导入BCG感受态细胞。通过温度诱导促进融合基因的表达,利用western-blot检测目的蛋白的表达。构建EB病毒阳性鼻咽癌动物模型,利用获得的rBCG对实验动物进行免疫,定期测量肿瘤组织长径和短径并计算其体积。一段时间后将实验动物处死,获取肿瘤组织,称重并计算肿瘤组织抑制率,HE染色观察炎性细胞浸润情况。结果从B95-8细胞中提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰,明暗分明,质量较好,利用PT-PCR获得了LMP1全长cDNA,并以cDNA为模板设计特引物扩增获得了1225 bp的LMP1。以含目的基因IL-2的质粒为模板扩增获得453 bp IL-2,利用overlap-PCR扩增获得1623bp IL-2-LMP1融合基因。将融合基因连接到质粒pMV261,经筛选、克隆后进行PCR、酶切、测序鉴定。PCR扩增获得1600bp左右的片段,与融合基因大小基本一致,酶切获得1600bp与4500bp左右两条片段,大小与预期一致,测序结果显示该融合基因序列与已知序列一致性为100%。利用电转仪将构建好的重组质粒导入BCG感受态细胞,经温度诱导后利用western-blot可以检测到外源基因融合蛋白的表达。在动物实验中rBCG组、BCG组、PBS组成瘤时间无明显差异,各组肿瘤体积无明显差异。免疫接种后同一时间rBCG组肿瘤体积小于PBS组和BCG组,BCG组小于PBS组。rBCG组平均瘤重小于BCG组、PBS组,BCG组与PBS组之间无明显差异,rBCG组肿瘤抑制率38.00%高于BCG组11.91%。肿瘤组织HE染色结果显示,rBCG组肿瘤组织有明显的淋巴细胞、中性粒细胞浸润。结论构建获得了pMV261-IL-2-LMP1重组质粒,并成功将重组质粒导入BCG,获得了能够稳定表达融合蛋白的rBCG,构建的rBCG对EB病毒阳性鼻咽癌肿瘤具有抑制作用。
【图文】：

序列,片段,抗生,检测融合

济南大学硕士学位论文病毒永生化的 B95-8 细胞提取总 RNA，利用 RT-PCR 合成 cDNA,引物合成 LMP1 全部序列。以质粒 IL-2 pMalLP 为模板设计引物合在引物中引入 Linker（Gly4Ser）3，利用重叠 PCR 将两段目的基因基因。将融合基因连接到 pMV261 载体上,将通过 PCR、酶切、测质粒 pMV261-IL-2-LMP1 通过电转导入感受态 BCG。将通过抗生度诱导促进融合蛋白的表达，使用 western-blot 检测融合基因在 B案与技术路线

路线图,实验技术,路线图,培养瓶

图 2 实验技术路线图Fig.2 Experimental technology roadmap.2 EB 病毒总 RNA 的提取.2.1 细胞培养：使用含 10%胎牛血清的 RIMI 1640 复苏 B95-8 细胞，初次接收细胞时将细胞在室温下静置半小时然后用 75%酒精对培养瓶进行消毒处理。将培养瓶转移到紫外照射的生物安全柜中，将培养瓶中的培养液取出 1000 r/min 离心 4min，将原来培养基转移到新的培养瓶中。使用新的培养基将细胞沉淀吹打混匀后分装到新的加入培养基的培养瓶中置于 CO2生化培养箱中培养，同时取部分沉淀使用原来的培养基行培养以最大程度保持细胞原来的生活条件，防止细胞对不同厂家培养基的适应性存差别而造成损失。B95-8 细胞为半悬浮半贴壁生长细胞，细胞换液、传代时应注意将胞充分吹打混匀否则容易聚集成团，造成生长缓慢甚至死亡。此外，，操作过程中应注
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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