人工合成多肽MAC-1抗乙型肝炎病毒活性及机制初探

发布时间：2020-06-12 09:33

【摘要】：目的:初步探讨人工合成多肽MAC-1(以下简称MAC-1)体外和体内抗乙型肝炎病毒作用及机制。方法:1、以转染人HBV全基因组的人肝癌细胞(HepG2.2.15)为体外细胞模型。(1)MAC-1对HepG2.2.15细胞的活性作用,不同浓度MAC-1(10,100,1000,2000,10000μg/ml)作用细胞48h,采用MTT方法检测细胞活性;(2)MAC-1抗HBV活性作用,根据不同组别:连续用药对照组(Control L),间断用药对照组(Control J),低、中、高(10,50,100μg/ml)三个MAC-1浓度组,恩替卡韦连续用药组(3.75nmol/L ETV L),恩替卡韦间断用药组(3.75nmol/L ETV J)分别作用HepG2.2.15细胞3d、6d、9d,采用实时荧光定量核酸扩增技术(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测上清液HBV DNA、HBeAg和HBsAg水平。(3)MAC-1抗HBV的作用机制,根据不同剂量10,50,100μg/ml MAC-1分别作用24h,用逆转录实时荧光定量PCR(reverse transcriptionreal time quantitative PCR,RT-qPCR)检测细胞内3.5kb RNA、HNF1α、HNF4α的基因相对表达水平;采用Western Blot检测细胞内pERK,tERK,HNF1α,HNF4α的蛋白相对表达水平。2、以感染的雏鸭构建鸭乙型肝炎病毒(DHBV)动物模型。(1)感染雏鸭随机分为高浓度MAC-1组(40mg/ml/kg),低浓度MAC-1组(20mg/ml/kg),病毒对照组(生理盐水),恩替卡韦对照组(0.1mg/kg);未感染雏鸭随机分成2组:MAC-1对照组(40mg/ml/kg),阴性对照组(生理盐水)各组采用腹腔注射的方法处理10天,分别在雏鸭用药前(D0),用药第五天(D5),用药第十天(D10),停药第三天(P3)四个时间点颈静脉采血并称量体重,采用ELISA方法检测各时间点血清中DHBsAg、DHBeAg的水平,采用qPCR方法检测血清中DHBV DNA病毒的含量,采用组织病理切片法观察雏鸭肝脏组织的病理变化。结果:1、MAC-1体外对乙型肝炎病毒的影响及其作用机制研究。(1)MAC-1对HepG2.2.15细胞存活率影响:MAC-1小于1000μg/ml浓度下,对细胞没有明显毒性作用(P0.05);(2)MAC-1对HepG2.2.15细胞上清液中HBV的影响:三个浓度MAC-1与Control J比较,均作用使细胞上清液HBsAg、HBeAg、HBV DNA的表达减少(P0.05);(3)MAC-1对HBV作用的机制,各剂量MAC-1组与Control J组比较,3.5kb RNA及肝细胞内HNF1α、HNF4αmRNA表达均没有显著差异(P0.05),t-ERK和p-ERK信号蛋白和HNF1α蛋白没有统计学差异(P0.05),HNF4α蛋白表达出现显著下调,随着MAC-1浓度增加下调越明显(P0.05)。2、以感染DHBV雏鸭为动物模型。(1)MAC-1对雏鸭血清DHBV复制:低和高浓度MAC-1组分别在T0、T5、T10和P3天,干预前后其DHBV DNA浓度无显著差异(P0.05),与病毒组比较DHBV DNA、HBsAg、HBeAg水平无明显差异(P0.05);(2)MAC-1对雏鸭体重与肝脾指数的影响:随着时间的延长,雏鸭体重逐渐增加,各组之间比较无统计学差异(P0.05),雏鸭肝脏指数和脾脏指数各组间比较均无差异(P0.05);(3)MAC-1对雏鸭肝脏组织病理的影响:病毒组炎细胞浸润病变较重,部分淤血等病理改变,MAC-1组炎细胞浸润与病毒组比较有减轻病理变化。结论:1、MAC-1可抑制HepG2.2.15细胞系上清液HBV DNA、HBsAg、HBeAg的水平;2、MAC-1抑制HBV复制可能通过下调HNF4α表达,但可能不是通过激活ERK1/2信号通路;3、MAC-1对雏鸭体内DHBV DNA和DHBsAg、DHBeAg表达无明显抑制作用;4、MAC-1一定浓度范围内可能具有改善HBV引起肝脏炎性病变的作用。
【图文】：

多肽,组间,纯度,方差齐性

Marker 朝左放入多功能凝胶成像系统中曝光。1.2.5 统计分析实验数据用均数±标准差（ ±s）表示，组间比较用 one-wayANOVA 方法进行分析。方差齐性时，采用 LSD 方法进行组间多重比较。用统计软件 SPSS 22.0 进行分析，P＜0.05 为差异有统计学义。2 结果2.1 MAC-1 的鉴定MAC-1 纯度及其结构分析高效液相色谱分析 MAC-1 多肽的纯度>95%，质谱分析分子量 3022.6Da。利用 RCSB PDB Server 和 I-TASSER On-line Server系统数据库对 MAC-1 的氨基酸序列进行多肽结构预测，以 α 螺旋为主，少量 β折叠（如图 2-1, 图 2-2）。由于 MAC-1 多肽序列专利申请中，未展示。χ

质谱分析,多肽

Marker 朝左放入多功能凝胶成像系统中曝光。1.2.5 统计分析实验数据用均数±标准差（ ±s）表示，组间比较用 one-wayANOVA 方法进行分析。方差齐性时，采用 LSD 方法进行组间多重比较。用统计软件 SPSS 22.0 进行分析，P＜0.05 为差异有统计学义。2 结果2.1 MAC-1 的鉴定MAC-1 纯度及其结构分析高效液相色谱分析 MAC-1 多肽的纯度>95%，质谱分析分子量 3022.6Da。利用 RCSB PDB Server 和 I-TASSER On-line Server系统数据库对 MAC-1 的氨基酸序列进行多肽结构预测，，以 α 螺旋为主，少量 β折叠（如图 2-1, 图 2-2）。由于 MAC-1 多肽序列专利申请中，未展示。χ
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373

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