人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1抗原定量及免疫原性研究

发布时间：2020-06-14 08:16

【摘要】：世界范围内,宫颈癌为女性第四位高发恶性肿瘤。高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是宫颈癌的主要致病因素。HPV结构基因编码主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2),两者共同形成病毒的二十面体衣壳。外源表达的L1蛋白可以在体外自组装成病毒样颗粒(VLPs),其超微结构和免疫原性与天然病毒类似,目前已上市或在研的HPV预防性疫苗均以上述HPVL1 VLPs为基础。HPV预防性疫苗至少含有两个型别的L1抗原,甚至更多型别的L1抗原,所有HPV疫苗均含有HPV 16 L1抗原。本课题对多价疫苗中HPV16 L1抗原的定量及免疫原性特点进行了深入研究,并得到以下结果。1.HPV16 L1抗原ELISA定量方法的建立与应用目前已有三种HPV预防性疫苗在我国上市,国内还有9家企业15个品种的HPV预防性疫苗处于不同的研究阶段。现阶段各生产企业利用各自的HPV16型特异性单抗建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)以检测各自的HPV16 L1抗原,使抗原检测结果差异大。因此急需筛选一株具有代表性的HPV16型特异性单抗以建立统一的ELISA抗原检测方法。比较分析13株具有中和活性的HPV16单抗,HPV16.001的中和活性最强,IC50为0.6ng/mL。从中和活性最强(IC5010ng/mL)的6株单抗中选择4个代表株进行结合特性分析,HPV16.001结合亲和力最高(EC50:2.6ng/mL)且结合最稳定,不受抗原表达系统的影响。竞争抑制实验表明HPV16.001识别HPV16 VLPs上主要的中和表位而且能够代表免疫后血清中大部分中和抗体。以中和活性高、结合特性好而且具有表位优势的HPV16.001为基础,建立了统一的ELISA抗原检测方法。通过对线性、特异性和精密度等方法学参数进行验证,表明本研究建立的双抗体夹心ELISA方法适用于HPV16 L1抗原的定量检测,可用于HPV16 L1抗原鉴别和相对效价测定。2.HPV多价联合疫苗中16型和18型L1抗原质谱定量方法的建立与应用目前HPV预防性疫苗均是以HPV VLPs为基础的多价联合疫苗,从2价联合到14价联合。传统的蛋白定量方法,例如BCA法,无法区分定量每一型别HPVL1抗原。双抗体夹心ELISA法虽然可以区分定量各型别L1抗原,但筛选出针对10余种型别中每一型别L1抗原的特异性单抗耗时耗力,且ELISA法的定量易受疫苗中佐剂的影响。因此急需建立质谱检测方法,解决HPV多价联合疫苗中各型别L1抗原同时定量的问题。本研究基于稳定同位素标记的质谱定量的分析思路,在肽段基本筛选指标基础上,增加肽段特异性和质谱特性指标,确定HPV16L1和HPV18L1蛋白的定量特征肽段分别是AGAVGENVPDDLYIK和FSLDLDQYPLGR。使用稳定同位素标记的定量特征肽段作内标,建立了 HPV多价联合疫苗中HPV16 L1和HPV18 L1蛋白的质谱检测方法。HPV单价样品和多价联合疫苗经0.1%RSF变性和胰蛋白酶酶解后,进行质谱测定,采用稳定同位素内标法定量。结果表明,HPV16 L1和HPV18L1蛋白在20-500nM范围内线性关系良好,相关系数R2分别是0.998和0.995。方法的最低检测限分别为1.0nM和0.5nM,最低定量限分别为2.8nM和1.7nM,日内回收率分别为83.96%～113.57%和81.40%～100.43%,日间回收率分别为86.00%～100.20%和87.10%～103.49%,日内精密度分别为1.12%～4.65%和0.79%～5.91%,日间精密度分别为5.09%～10.59%和4.17%～11.05%。该质谱法测定的Gardasi1中HPV16 L1和HPV18 L1蛋白的含量分别是46.9±0.8g和17.2±0.28g,Gardasil9中分别是51.2±2.0μg和33.2±0.6μg,均与标示量相近。本研究建立的质谱定量方法简单、快速、准确、灵敏,可同时定量HPV多价联合疫苗中的HPV16L1和HPV18L1蛋白。3.HPV16 L1抗原的免疫保护活性涵盖L1突变株的研究随着HPV16病毒的进化,HPV16型内变异株越来越多。对截止至2016年底的所有1204个HPV16型内变异株L1蛋白的序列进行分析,发现505个氨基酸中,270个位点发生变异,变异率为0.08%～20.18%。为分析HPV16预防性疫苗株对这些自然点突变株的保护效果,利用定点突变技术构建39个点突变株,包括自然状态下的高频突变位点和表位相关突变位点。利用真核蛋白表达系统,成功包装31株高滴度HPV16突变假病毒。利用假病毒为基础的中和实验(PBNA)分析31株突变假病毒对单抗和免疫血清的中和敏感性变化。结果表明,21株突变假病毒对某些单抗的中和敏感性发生变化,其中20株突变假病毒对某些单抗的中和敏感性下降,8株突变假病毒对某些单抗的中和敏感性上升,6株突变假病毒对某些单抗彻底失去了反应性。免疫血清虽然可中和上述31株单点突变假病毒,但C428W和K430Q两株突变假病毒对免疫血清的中和敏感性分别下降9倍和11倍。本部分结果表明,截至目前,HPV16预防性疫苗株尚能够诱导高效广谱的保护性免疫,但HPV16L1的抗原性正在发生变化,需要密切监测。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392
【图文】：

宫颈癌,年龄,宫颈,筛查

高危型ＨＰＶ持续感染是宫颈癌的主要致病因素。世界范围内，宫颈癌为女性逡逑第四位高发恶性肿瘤，构成全球女性健康重大挑战。２０１８年宫颈癌新增病例约５７逡逑万，死亡病例约３１万［１６］。约９０％的宫颈癌死亡病例发生在中低收入国家（图１．２［１７＾），逡逑其死亡率是发达国家的１８倍［１８］。宫颈癌的高危因素包括易感染ＨＰＶ行为、使ＨＰＶ逡逑免疫应答受损行为或两者兼具的行为［１９，２（）］。具体包括：性伴侣多、过早性生活、免逡逑疫抑制、性传播疾病导致的宫颈炎症对宫颈的长期刺激、ＨＰＶ相关的外阴或阴道疾逡逑病史、无宫颈筛查等［２１，２２］。宫颈癌的发病主要与ＨＰＶ感染引起机体内源性因素产逡逑生影响，如相关癌基因激活、抑癌基因失活、端粒酶活性高表达和机体免疫调节机逡逑制失衡等一系列病理改变，引起细胞增殖与凋亡调节异常，导致组织癌变［２３］。具体逡逑的发病机制如图１．３『２４，２５］所示。宫颈筛查和接种ＨＰＶ预防性疫苗是预防宫颈癌的最逡逑有效措施［２４］。逡逑９逡逑

多反应监测,经典,母离子,四级

ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ，ＴＳＱ）串联质谱仪，，也可以在四极杆－飞行时间质谱仪（Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－ｔｉｍｅ逡逑ｏｆｆｌｉｇｈｔ，Ｑ－ＴＯＦ）或线性离子讲（Ｌｉｎｅａｒｉｏｎｔｒａｐ）质谱仪上进行。基于三重四级杆逡逑质谱仪的ＭＲＭ实验原理如图１．５所示［２３］。在三个串联的四级杆中，第一个四级杆逡逑（Ｑ１）用于过滤母离子，只有被预先选择的母离子才可以通过Ｑ１，进入第二个四逡逑级杆（Ｑ２）。Ｑ２作为碎裂腔，对于过滤后的母离子进行碎裂，通常是碰撞诱导碎逡逑裂模式（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＣＩＤ）。但亦有研宄采用高能碰撞诱导碎裂逡逑模式（Ｈｉｇｈ邋ｅｎｅｒｇｙ邋ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＨＣＤ），ＨＣＤ邋的灵敏度比邋ＣＩＤ邋好。逡逑第三个四级杆（Ｑ３）用于过滤子离子，只有符合预先设定条件的子离子才能通过Ｑ３，逡逑从而进入检测器中。多重反应监测技术通过选择目标蛋白的特定母离子和子离子对，逡逑显著提高了目标肽段的信噪比，是一种极具前景的高通量靶向蛋白定量技术。该技逡逑术具有灵敏度高、准确性好、特异性强的优点

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