大鼠室旁核内多巴胺受体的分布及其与糖代谢相关的形态学观察初探

发布时间：2020-06-14 21:47

【摘要】：背景帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种以黑质(substantia nigra,SN)多巴胺能神经元的大量丢失为主要病理特征的中枢神经退行性疾病。临床上的PD患者常出现静止性震颤和慌张步态等躯体运动障碍。此外,PD患者所表现出的如睡眠障碍、代谢异常、嗅觉障碍、消化不良和体位性低血压等的非运动症状被逐渐重视。相关研究表明,帕金森病人在早期就会出现糖代谢紊乱的症状。下丘脑室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus,PVN)能分泌多种激素,对于维持体内环境的稳态起到至关重要的作用。并且,下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis,HPA轴)最初的应答驱动点开始于PVN,它是促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)神经元的主要合成部位,CRH通过作用于腺垂体促使促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)释放到正中隆起的垂体门静脉血管中,ACTH又可从垂体释放并通过全身循环传播到肾上腺皮质,在肾上腺皮质中促进糖皮质激素(glucocorticoid,GC)的合成和分泌,参与机体血糖调节。糖皮质激素在动物体内主要以皮质酮(corticosterone,CORT)的形式存在。本课题组前期研究发现,SN到PVN内有多巴胺能神经纤维的投射。但患有PD时中枢多巴胺能纤维的改变是否会导致HPA轴通路异常的相关报道相对较少。我们推测PD时,SN投射到PVN的多巴胺纤维减少,可能导致HPA轴通路异常以致最终引发全身血糖调节的紊乱。目的以6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)大鼠为研究模型,观察其糖耐量、HPA轴上ACTH和CORT的含量变化,并证实PVN内多巴胺受体1和2(dopamine receptor 1 and 2,D_1/D_2)表达的改变,以及D_2与CRH的共表达,为PD病人发生糖代谢紊乱的可能机制提供形态学依据。方法1.使用脑立体定位仪将6-OHDA注射入大鼠双侧SN,破坏SN内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达。2.运用腹腔内注射葡萄糖耐量实验比较Control组和6-OHDA模型组大鼠的血糖变化。3.利用尼氏染色技术对脑内核团SN和PVN进行定位。4.使用免疫组化二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)显色技术检测大鼠SN内TH的破坏情况。5.使用免疫荧光技术检测PVN各亚细胞部上D_1和D_2的表达。6.利用免疫荧光双标观察PVN内D_1与加压素(vasopressin,VP)、D_1与催产素(oxytocin,OT)、D_2与VP、D2与OT、TH与D_1、TH与D_2和D_2与CRH的共表达。7.使用免疫印迹法(western blot,WB)检测下丘脑内的TH、D_1、D_2和CRH的蛋白含量。8.运用放射性免疫实验方法检测血液和组织中ACTH以及CORT的含量。结果1.尼氏染色结果显示经6-OHDA处理的大鼠SN部位的神经元数目显著减少,尼氏体模糊,颗粒及密度均降低;SN的TH免疫阳性神经元的数目显著减少。2.6-OHDA模型组大鼠经腹腔注射葡萄糖后,15 min和30 min时血糖明显高于Control组,表明其糖耐量降低。3.与Control组相比,6-OHDA组大鼠垂体组织中的ACTH和血液中的CORT都有升高的趋势,表明6-OHDA组大鼠HPA轴被活化。4.在Control组大鼠PVN的各个细胞分部上都有D_1和D_2的表达,而且在大细胞部外侧大细胞部(paraventricular hypothalamic nucleus,lateral magnocellular part,PaLM)上,D_1与VP和OT都有共表达,D_2与VP和OT同样也都有共表达。5.在PVN上,有大量的TH纤维围绕在D_1或D_2周围。在Control组上,PaLM大多数TH阳性神经元同时表达D_1或D_2,CRH与D_2的共表达也大量存在。而6-OHDA模型组大鼠上,D_2和TH神经元表达明显减少,CRH表达增多,D_1无明显变化。结论D_1和D_2广泛表达在PVN,不仅分布在VP和OT神经元上,还大量分布在CRH神经元上。损伤SN可以引起大鼠糖耐量下降、PVN上D_2表达减少、CRH免疫阳性神经元增多、以及垂体内组织内的ACTH、血液中CORT的含量升高。提示:黑质多巴胺能神经元可能通过SN-PVN投射在D_2的介导下调节CRH神经元功能。该研究为多巴胺通过介导PVN上CRH能神经元调节机体糖代谢提供了形态学依据。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.5;R-332
【图文】：

蛋白表达,大鼠,酪氨酸羟化酶,黑质

图 1：6-OHDA 模型组大鼠 SN 上的 TH 免疫阳性和蛋白表达。黑色虚线框内是 SN 所在部位，棕色代表 TH 阳性表达。A. Control 组（左）与 6-OHDA 模型组（右），Scale bar: 100 μm。B. WB 结果显示 Control 组和 6-OHDA 模型组大鼠 SN 内 TH 的蛋白表达。以 GAPDH 作为内参。C. 直方图显示，与 Control 相比，6-OHDA 模型组大鼠 SN 中 TH 蛋白表达明显下降。SN: substantia nigra，黑质；THtyrosine hydroxylase，酪氨酸羟化酶（***P＜0.001）Figure 1: TH immuno-positive and protein expression on SN in rats of 6-OHDA model group. SN ilocated in the dotted black box, and brown represents the positive expression of TH. A. Control group (leftand 6-OHDA model group (right), Scale bar: 100 μm. B. Western blot results showed the protein expressionof TH in SN in rats at the control group and the 6-OHDA model group. GAPDH was used as the internareference. C. Histogram showed that, compared with the control group, the expression of TH protein in SN inthe 6-OHDA model group was significantly decreased. SN: substantia nigra; TH: tyrosine hydroxylase (***P＜0.01)1.2 血糖鉴定

葡萄糖耐量,冠状,血糖,分部

和 6-OHDA 模型组大鼠腹腔葡萄糖耐量检测。从图中可以看出，腔注射葡萄糖后，与 Control 组相比，6-OHDA 组血糖在 15 min 6-OHDA 模型组大鼠糖耐量出现降低了的症状。IPGTT：腹腔e tolerance in 2 h of rats in the control group and the 6-ohda mode there was no difference in fasting blood glucose between the twon of glucose, compared with the control group, the blood glucosy higher at 15 min and 30 min than that of the control group, indicatiHDA model group was reduced. IPGTT: glucose tolerance test 学观察的方法对 PVN 的各个细胞分部进行定位。通过冠状切

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