基于TALE组装的DNA支架增强外源多酶代谢通路
发布时间：2020-06-15 01:46
【摘要】：如今,随着合成生物学和代谢工程的发展,将级联酶系统整合进入能够自主复制的微生物中以形成微生物工厂的概念,为生物合成多种化合物提供了广泛的新方法以及创新性的平台。然而异源代谢通路在原核底盘微生物中的细胞内酶共聚化效应通常受到限制,这会导致酶和底物在区域化范围内的浓度较低,进而可能会限制代谢通路的生产效率。因此,多项研究均将目标集中在重新排布细胞内分子与分子间的相互作用以达到异源通路代谢酶的共聚化,增强合成的代谢通路效应。这种共聚化的方法被称之为人工合成支架系统,是一种重要的代谢流路控制和代谢通路增强的方法。另外,甲羟戊酸(Mevalonate,MEV)途径是在真核生物、古细菌和部分真细菌中存在的多种类异戊二烯化合物的主要合成途径,其中中间代谢产物甲羟戊酸合成过程是关键限速步骤。类异戊二烯在日常生活和工业生产中已经在医药、能源、农业、化工等领域具有广泛的应用价值,然而其天然产物来源不足,而原核细胞异源合成方式也存在代谢酶系缺乏有效聚集机制,影响了其对中间产物毒性的控制和产量的提升。本课题中,我们在大肠杆菌中为人工合成的三酶代谢途径,构建了一种基于DNA的支架系统。这种支架系统引起的三酶共聚化效应,首先通过三个割裂片段的绿色荧光蛋白(split-GFP)系统得到证实。将三个部分的割裂绿色荧光蛋白片段(G1～9,G10和G11)分别与类转录激活因子效应物TALE1,TALE2和TALE3蛋白结合形成融合蛋白,随后这种设想的结构表现出与DNA适当结合并完成完整绿色荧光蛋白的重建。当割裂的绿色荧光蛋白重新获得蛋白质活性发出荧光时,此时它们在空间上以极近的距离聚集成簇,相比于不使用支架的对照组,荧光强度的增强归因于支架系统的共聚化效应。而通过共聚化外源甲羟戊酸合成通路中的三个代谢通路酶:乙酰-CoA乙酰转移酶(AtoB)、三羟基三甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶(HMGS)、三羟基三甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶(HMGR)验证了这种通路增强效应在三酶代谢途径中的应用。以DNA质粒作为支架,将外源的酶与合理设计的TALEs蛋白融合,我们的方法增强了与TALE融合的酶集成簇的催化活性,并成功使生产甲羟戊酸的三酶途径的产量增长大约3.7倍,与以前研究过的其他DNA支架系统所取得的效果相似,甚至更好。另外,我们通过筛选酶的聚集效应和甲羟戊酸产量,得到最佳支架结构的相关参数,涉及间隔距离以及结合位点顺序。这些结果进一步说明了基于TALE的支架系统具有良好的扩展性以及稳定性,并且可以假设,由于该支架系统被程序化设计的特性,能将其用于其它的多酶代谢通路。
【学位授予单位】：国防科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378.21
【图文】：
因为此时成本要求非常严格。因此，现有的工业化生产宿玄具有能够应用逡逑的基因工具非常关键，这些宿主可以在简单的、低成本的碳源和盐的环境中生长，逡逑或者＾￡低成本的、最小限量添加物的天然培养基中生长［１７，１８］。常见宿主如图１．３逡逑所示。逡逑Ｒ棚逡逑Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ邋ｃｏｌｉ逦Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ邋ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ逡逑图１．３大肠杆菌和酿酒酵母逡逑１．１．３．１外源基因导入和代谢平衡逡逑问题的关键在于，需要遗传学工具将编码代谢通路的外源基囡和控制它们的逡逑表达以达到最大产f埡托Ъ鄣耐庠椿虻既胨拗鳌Ｔ诖还こ谈脑斓南赴校忮义闲┍嗦胱傅幕虿恍枰罅勘泶铮匦氡泶锊龅揭欢ǖ拇呋潦浚沐义瞎皇实钡刈恢屑洳锷伤璧牟铮锏酱呋ズ退健９龤俚乇泶锼义闲璧幕蚪峁嗟芈佣嵯赴拇晃铮跋熳钪詹锏暮铣桑裨蛘庑┐晃镥义显蚩梢杂糜谒枘勘瓴锏纳乇鸲砸恍┳畹拖薅攘炕镏实纳浅Ｖ劐义弦欢捅泶锘蛟蚧嵩斐纱煌菲烤薄４送猓灌镂庠创煌分械腻义洗恢屑湮锟赡芏砸煸此拗饔卸拘
本文编号：2713701
【学位授予单位】：国防科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378.21
【图文】：
因为此时成本要求非常严格。因此，现有的工业化生产宿玄具有能够应用逡逑的基因工具非常关键，这些宿主可以在简单的、低成本的碳源和盐的环境中生长，逡逑或者＾￡低成本的、最小限量添加物的天然培养基中生长［１７，１８］。常见宿主如图１．３逡逑所示。逡逑Ｒ棚逡逑Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ邋ｃｏｌｉ逦Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ邋ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ逡逑图１．３大肠杆菌和酿酒酵母逡逑１．１．３．１外源基因导入和代谢平衡逡逑问题的关键在于，需要遗传学工具将编码代谢通路的外源基囡和控制它们的逡逑表达以达到最大产f埡托Ъ鄣耐庠椿虻既胨拗鳌Ｔ诖还こ谈脑斓南赴校忮义闲┍嗦胱傅幕虿恍枰罅勘泶铮匦氡泶锊龅揭欢ǖ拇呋潦浚沐义瞎皇实钡刈恢屑洳锷伤璧牟铮锏酱呋ズ退健９龤俚乇泶锼义闲璧幕蚪峁嗟芈佣嵯赴拇晃铮跋熳钪詹锏暮铣桑裨蛘庑┐晃镥义显蚩梢杂糜谒枘勘瓴锏纳乇鸲砸恍┳畹拖薅攘炕镏实纳浅Ｖ劐义弦欢捅泶锘蛟蚧嵩斐纱煌菲烤薄４送猓灌镂庠创煌分械腻义洗恢屑湮锟赡芏砸煸此拗饔卸拘
本文编号：2713701
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