复制压力诱导损伤染色体的非随机分离及其机制研究

发布时间：2020-06-18 05:35

【摘要】：细胞分裂分为对称细胞分裂(SCD)和不对称细胞分裂(ACD)。不对称和对称有丝分裂之间的平衡在整个生命周期的时间和空间上必须得到精确控制。协调细胞不对称分裂需要控制大量的细胞内外生物过程和信号网络,这些事件的干扰导致细胞群内自我更新和分化的动态改变,这与癌症的生长和进展高度相关。染色体DNA的非随机分离是细胞不对称分裂中的一个关键科学问题,即携带母本旧DNA链的染色单体仅由两个子细胞之一继承。虽然这一现象已经在几个物种和细胞类型中观察到,但我们对非随机DN A分离的机制和生理相关性知之甚少。已有研究显示,肌肉干细胞的不对称细胞分裂频率受氧张力的显着影响;骨骼肌急性组织损伤中,也可以观察到肌肉干细胞中的染色体的非随机分离[62];人肺癌细胞中也描述了在染色体模板DNA链的非随机分离与细胞接触、高细胞密度、低氧(1%)和血清剥夺相关。这些证据都提示了染色体DNA非随机分离可能受到微环境的调控。此外,染色体的成功复制,及随后在有丝分裂期间的均匀分离对基因组稳定性维持至关重要。研究证明复制压力受微环境的精细调控,且对基因组的稳定性维持至关重要。因此,我们猜想,复制压力是否诱导了染色体DNA的差异化,进而影响了染色体DNA的非随机的分布。本团队在人骨肉瘤(U-20S)细胞上利用APH等复制压力诱导试剂引发复制压力的产生,证明了复制压力可以诱导染色体模板DNA的非随机分离,而且癌基因诱导的DNA复制压力(RS)也能诱导染色体模板DNA的非随机分离,这提示诱导染色体DNA的非随机分离与癌症相关。进一步的数据显示,子代细胞对染色体DNA的这种偏倚遗传伴随着DNA损伤反应(DDR)的不对称分布,且这种不对称的DNA损伤反应主要发生在端粒上。机制上,本研究发现,ATR/CHK1信号通路在端粒DNA损伤不对称分布介导的染色体DNA非随机分离中起着重要作用。此外,本研究利用活细胞工作站,通过实时动态观察到继承母本旧DNA链的子细胞保持了基因组的稳定性,而携带受损DNA链的子细胞则经历了细胞周期停滞或细胞死亡。本团队在损伤染色体DNA非随机分离方面的研究,不仅为复制压力诱导的癌细胞群的基因组稳定性维持提供了深入了解,而且还为开发新的癌症诊断和治疗方法提供了新思路。综上所述,本课题首次发现了 DNA损伤反应在有丝分裂后的不对称分裂,这种不对称分裂的DNA损伤反应偏好定位在端粒上,且依赖于有丝分裂期的ATR/CHK1信号通路。更为重要的是,我们发现DNA损伤反应的不对称分裂促进染色体DNA非随机分离,可能是染色体DNA非随机分离的一个潜在机制。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R346
【图文】：

随后在有丝分裂期间均匀分离。基因组不稳定性不仅是癌细胞的标志，更逡逑重要的是，它也是基因组疾病和癌症易感性的原因［１］。在ＤＮＡ复制过程中发生的逡逑错误可能影响染色体的准确复制和有丝分裂期间的相等分离（图１，引自Ｉｎｄｉａｎａ逡逑Ｍａｇｄａｌｏｕｅｔａｌ，２０１４）邋［２，３］。因此，复制压力已成为基因组不稳定的主要来源［４］。逡逑尽管如此，目前却依然没有统一清晰的描述定义复制压力，甚至是没有一组逡逑明确标记复制压力的细胞标记物。实际上，复制压力的诱因很多，或内源性（例逡逑如不适当的细胞代谢条件）或外源性（例如暴露于ＤＮＡ损伤或复制阻断）；作用逡逑范围或在局部起作用（离散的暂停位点）或全局地发生在复制动力学上，并且在逡逑细胞中产生了许多影响，根据它们的来源或分子基础来统一它们仍然具有挑战性逡逑［５］。因此，复制压力的定义是在不断地发展，它涵盖了邋ＤＮＡ复制程序中在时间和逡逑空间上受许多因素严格控制的各种事件，可被定义为复制叉进展和／或ＤＮＡ合成逡逑的减慢或停滞。主要包括四大类：（１）复制起点不足（缺乏或过量）；（２）分叉进逡逑展的障碍；（３）复制和转录之间的冲突；（４）在不适当的代谢条件下的ＤＮＡ复制逡逑（不平衡的ＤＮＡ复制）［６］。逡逑１逡逑

３．１复制压力促进染色体ＤＮＡ的非随机分离逡逑３．邋１．邋１邋Ｐｕｌｓｅ－ｃｈａｓｅ实验的建立与验证逡逑我们参考经典的标记ＤＮＡ的方法之一（ｐｕｌｓｅ－ｃｈａｓｅ实验），利用胸腺定类逡逑似物ＣｌｄＵ标记细胞ＤＮＡ两周以上，然后在１２孔板中将细胞接种在多聚赖氨酸包逡逑被的坡上片，继续使用含有ＣｌｄＵ的培养基追踪培养，待细胞爬片后，冰乙醇固定，逡逑进行ＣｌｄＵ荧光染色验证Ｕ－２０Ｓ细胞脉冲两周后的ＤＮＡ被ＣｌｄＵ标记的情况。显微逡逑镜取图并统计ＣｌｄＵ阳性细胞，结果显示Ｕ－２０Ｓ细胞在ＣｌｄＵ脉冲两周后的ＤＮＡ标逡逑记比例高大９８．邋８６％以上（图３．邋１．邋１）。因此，我们可以采用ＣｌｄＵ脉冲两周后的细逡逑胞进行后续的ＤＮＡ是否非随机分布的实验研究。逡逑ａｉｂ—逡逑

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本文编号：2718778