1、鸡蛋清溶菌酶与消散的油酸胶束相互作用并降低油酸胶束的细胞毒性 2、S100A9介导NF-κB（p65）入核动态变化对

发布时间：2020-06-19 22:29

【摘要】：目的:本实验以油酸(OA)胶束与鸡蛋清溶菌酶(HEWL)为模拟分子,解析淀粉样蛋白的聚集机制,并比较不同浓度OA胶束以及OAHEWL聚合体对SH-SY5Y细胞和神经干细胞(NSCs)的生物学效应,初步探讨OA胶束对淀粉样蛋白斑块形成的影响,进一步提高对阿尔兹海默症(AD)病理机制的认识。方法:为了保持OA胶束构象,所有样品都在800 rpm、pH 2.3和57℃条件下持续摇动;实验运用原子力显微镜(AFM)、ThT结合法、CD光谱法对淀粉样蛋白的纤维化过程进行初步表征。AFM是研究蛋白质聚集过程中动态变化的重要实验手段,可观察在不同条件下形成的淀粉样蛋白寡聚体、原纤维和纤维的形态结构并测量各结构的高度;采用ThT结合法监测蛋白质纤维化的动力学过程;运用CD光谱法分析蛋白纤维化过程中蛋白质二级结构变化。采用WST-1法和荧光显微镜连续成像法观察不同浓度OA胶束以及不同浓度OA-HEWL聚合体对SH-SY5Y细胞和NSCs的活性影响。结果:AFM结果显示,与对照组相比,OA100组形成大量的圆形寡聚体,这些寡聚体进一步结合形成纤维状结构,纤维高度最高可达60nm。ThT荧光染料可与蛋白质中的β-折叠结构特异性结合,用FluoroMax-2分光光度计测试蛋白样品的ThT荧光强度,结果发现HEWL组、OA10组、OA100组在50h前,OA100组ThT荧光强度最高,但增长率较缓;50h后,HEWL组增长速度最快,ThT荧光强度持续增高,高于OA10组和OA100组,而OA100组荧光强度最低。CD光谱结果显示,10h时,HEWL组、OA10组、OA100组所得曲线在208nm处有一最低负峰,此与α-螺旋结构的特征峰类似,而在7d时,在217nm处有一最低负峰,与β-折叠结构的特征峰一致。WST-1法和荧光显微镜结果显示,与对照组相比,在OA浓度为140μM时,OA对SH-SY5Y细胞和NSCs具有明显的增殖抑制作用(P0.01),而当OA与HEWL共孵育后,OA-HEWL对细胞的毒性明显减弱。结论:OA胶束与HEWL共孵育后可以促进类淀粉样蛋白板块的形成,并能显著降低OA对SH-SY5Y细胞和NSCs的毒性作用。目的:通过提取高纯度的S100A9蛋白和构建核转录因κB(NF-κB)p65基因过表达慢病毒载体并转染体外培养的SH-SY5Y细胞,观察S100A9介导的NF-κB(p65)入核动态变化对SH-SY5Y细胞系的生物学效应。方法:利用前期实验成功构建的原核表达质粒p ET28aS100A9,提取并转化质粒;使用IPTG诱导S100A9蛋白表达;采用SDS-PAGE和WB对S100A9蛋白进行验证;采用镍亲和柱分离并纯化蛋白;透析、浓缩并低温冻干获得蛋白粉;利用PCR方法获取目的基因片段RELA(p65),并构建慢病毒载体;琼脂糖凝胶电泳鉴定成功后用构建好的慢病毒载体转染293T细胞;以最适的MOI感染SHSY5Y细胞,并筛选SH-SY5Y稳转株;运用荧光显微镜和流式细胞术检测病毒转染效率;采用CCK-8法检测S100A9蛋白对SH-SY5Y稳转株活性的影响;运用Matlab(R2017a)分析软件分析S100A9蛋白对SH-SY5Y稳转株细胞核内外p65表达量的影响。结果:SDS-PAGE和WB证明成功获取了高纯度蛋白。琼脂糖凝胶电泳显示成功构建p65基因过表达的慢病毒载体;CCK-8结果显示S100A9对SH-SY5Y细胞具有明显增殖抑制作用(P0.05),且p65-GFP组的抑制作用没有对照组和空载组强,对照组和空载组二者无显著性差异;荧光显微镜和流式细胞结果显示构建的SH-SY5Y稳转株转染率约达90%,SH-SY5Y稳转株构建成功。Matlab分析结果显示S100A9蛋白可以激活NF-κB信号通路,引起p65入核,且入核与阳性对照TNF-α刺激NF-κB入核存在差异。结论:S100A9促进SH-SY5Y细胞增殖抑制可能是激活了NF-κB信号通路。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16;R329.2
【图文】：

外观,蛋白,原纤维,样品

/min 的扫描速度和 1nm 分辨率来获取光谱结果相对椭圆率表示。淀粉样蛋白质最初的状态主要成为原纤维或者成熟纤维后主要以 β-折叠二级结后光谱曲线特征峰位置的变化，初步判断原纤维WL（左），1.4mMHEWL+14mMOA（中）和 1.在 20 mM 甘氨酸缓冲液中以 800 rpm，pH 2.3 显示 HEWL 和 OA 混合物样品形成乳样外观，O

淀粉样蛋白,形貌结构,浓度,胶束

2.2 AFM 与荧光显微镜观察纤维形貌结构使用 AFM 连续 7 天观察在有或没有 OA 胶束存在情况下 HEWL 淀粉样蛋白纤维化的过程（图 1.2）。结果显示，HEWL 在孵育 1 天后，观察到有原纤维的形成，其高度约为 5nm，持续孵育到第 7 天的时候，并没有发现明显的结构变化（图 1.2 和图 1.3）。在低 OA 浓度（14mM OA）的条件下，与 HEWL 共孵育 1天后，原纤维形成与 HEWL 组原纤维形态类似，其高度也约为 5nm，同时出现较多圆形 HEWL 聚集体。与 HEWL 组和低浓度 OA 组相比较，140mM OA 与1.4mM HEWL 共孵育 1 天时，观察到大量圆形聚集体形成，这些寡聚体进一步聚集形成纤维网状结构（图 1.4），且 AFM 高度测量基本都大于 10nm，高度范围为 20~60nm，直径超过 90nm（图 1.2 和图 1.3），提示持续摇动作为一种搅拌方式，不仅可以促进 HEWL 淀粉样蛋白的形成，而且还可以帮助 OA 消散成小胶束（直径约 2μm），且 OA 胶束可诱导蛋白寡聚化和纤维化。

【参考文献】