MicroRNA-210对自噬的调控在大鼠心肌细胞缺血损伤模型中的作用

发布时间：2020-06-21 03:40

【摘要】：研究背景心血管疾病的患病率和死亡率均位于世界前列,心血管疾病的治疗和预防是现在临床研究的重点。缺血性损伤是导致心血管疾病的主要原因之一。当心脏血管出现阻塞或狭窄时,心脏组织局部缺血、缺氧,会造成组织的损伤。在心肌缺血阶段,及时恢复血流可以去除在缺血期间积聚在细胞外的氢离子,提供有氧呼吸ATP产生所需的氧气和底物。然而,很多研究表明,及时再灌注虽然能够在一定程度上挽救缺氧组织,但随着缺血时间的延长,恢复血流灌注后受损组织中会产生更加剧烈的损伤反应,放大组织损伤,这种损伤被称为缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/R injury)。缺血再灌注损伤会造成细胞内发生钙超载、活性氧及活性氮产物增多、内质网应激、线粒体损伤等一系列损伤性变化,进而导致细胞的凋亡、坏死等过程。有研究表明,短暂无害的I/R能提高心脏组织对随后暴露于长时间缺血的损害的耐受性,使得缺血后损伤显著降低,这展现出了I/R有益的一面。研究发现缺血及缺血再灌注损伤与细胞自噬、凋亡、坏死等过程密不可分。在细胞应对损伤的过程中,由于功能的多面性,自噬是近年来研究的重点。其被证明在心血管疾病中起到不同程度的调节作用。自噬是细胞内持续发生的一种生化过程,其作用是通过自噬体的形成包裹受损的细胞器和错误的蛋白,将其运送至溶酶体降解。因此,自噬在正常细胞中执行管家功能,主要作用是清除细胞内受损、衰老的大分子蛋白质以及细胞器。一方面,其提供氨基酸、核苷酸等物质供给细胞进行能量循环利用,促进细胞在饥饿状态下存活,另一方面也可能作为一种细胞防御机制保护受损细胞。在I/R过程中,由于能量供给不足、氧化应激以及内质网应激的发生,自噬途径被激活,并通过产生氨基酸和脂肪酸以维持细胞功能,或通过去除受损的细胞器来促进细胞存活。此外,由于局部缺血导致缺血部位细胞饥饿,因此自噬调控的细胞组分的分解可通过提供维持细胞能量水平的底物来促进细胞存活。但矛盾的是,虽然适度的自噬对维持细胞内稳态有重要作用,但过度的自噬则会引起相应组织脏器的功能障碍,进而发展至各种心血管疾病疾病。因此,自噬一直是细胞学研究的重点,寻找自噬的可能调控因子也是目前研究的热点之一。MicroRNAs(miRNAs)是由20-24个核苷酸组成的、具有高度保守序列的单链非编码RNA。在众多的miRNAs中,microRNA-210(miR-210)是公认的缺氧相关miRNA,并在多种细胞系中产生非常稳定的生物学效应。MiR-210调控的基因众多,但是只有一部分基因被证明可以在心血管相关模型中发挥调控作用。这些基因从凋亡、自噬、增殖、细胞迁移、能量代谢、血管生成等多个方面共同调节心血管系统面对缺氧时的保护反应,并提高细胞和个体对缺氧的适应能力。已知miR-210在多种心血管疾病患者的血浆中检测出有意义的变化,如动脉粥样硬化,急性冠脉综合征,心力衰竭,心脏瓣膜病,糖尿病心肌病等。所以,miR-210在心血管系统中的应用前景十分广泛,具有很好的研究价值。目前研究发现在众多的下游靶基因中,miR-210通过调控Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)可以影响多种细胞过程。BNIP3是BH3-only蛋白家族的一员,是一种典型的受缺氧调控的蛋白。由于其较BH3-only家族其他蛋白的结构及功能特殊性,其在凋亡过程中所行使的功能更加多样。其BH3-only区域可以与Bcl-2抗凋亡蛋白特异性结合,行使促凋亡功能。另外,其C端跨膜结构域还可以调控线粒体膜电位等相关功能,导致线粒体功能的破坏,从而进一步加剧细胞损伤。另外,BNIP3还在多个细胞系中证实可以对细胞自噬产生影响。研究表明BNIP3在心血管疾病中可以发生上调,且抑制BNIP3可以改善心肌损伤情况。所以,BNIP3在心血管疾病中的诊断及治疗意义有待进一步研究。研究目的在本研究中,我们利用缺氧培养大鼠心肌细胞H9c2构建心肌缺血模型。在模型中,我们通过检测细胞的凋亡、自噬等相关蛋白表达变化,探究此过程中凋亡和自噬信号通路是否被激活。通过检测miR-210及BNIP3蛋白的表达变化,以及miR-210表达对细胞活性、BNIP3和自噬的影响,探究miR-210在心肌缺血过程中的作用及其对自噬和BNIP3的调控作用。另外,我们还利用H9c2细胞构建缺血-再灌注模型,检测再灌注损伤过程中凋亡和自噬相关通路的变化探究自噬在此过程的调控作用,从而为miR-210在心血管系统的保护作用提供新的理论支持。研究方法1.对H9c2细胞进行缺氧培养,构建心肌缺血模型。使用CCK-8活性检测试剂盒检测细胞生存率,乳酸脱氢酶检测试剂盒检测LDH释放量,DCFH-DA探针检测细胞中ROS含量等方法评估缺氧期间细胞的损伤程度,并用Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白Caspase3,Bak,Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,观察缺血模型中细胞的损伤变化。利用Western blot检测缺血模型中自噬相关蛋白LC3B,p62的表达,并利用免疫荧光染色的方法检测LC3B蛋白含量及在细胞中的分布,探究缺血模型中自噬相关蛋白的变化。2.利用实时定量PCR的方法检测缺血模型中miR-210的表达变化。利用慢病毒转染构建空载质粒阴性对照及miR-210高表达及低表达模型,用荧光显微镜观察并利用实时定量PCR检测转染效率。检测转染后缺氧H9c2细胞活性、LDH释放量的变化,探究miR-210对细胞活性及损伤程度的影响。在miR-210高表达及对照组模型中检测凋亡相关蛋白Caspase3,Bak,Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,探究miR-210在H9c2细胞缺氧中对凋亡通路的调控作用。利用Western blot法检测miR-210高、低表达H9c2细胞中LC3B蛋白的表达,并用免疫荧光染色观察LC3B的点状聚集,探究miR-210对自噬的作用。利用实时定量PCR及Western blot检测缺血模型中BNIP3 mRNA及蛋白的表达变化及在miR-210高表达及低表达模型中miR-210对BNIP3的调控作用。利用siRNA构建BNIP3低表达模型,利用实时定量PCR及western blot方法检测BNIP3表达水平变化。在缺血模型中继续检测H9c2细胞活性、凋亡相关蛋白Caspase3表达,并利用Western blot观察LC3B的变化,探究BNIP3在缺血模型中的作用及其对凋亡、自噬通路的调控。3.利用H9c2细胞缺氧及缺氧后复氧过程构建H9c2细胞缺血-再灌注模型,检测模型中细胞的活性及LDH释放量变化以及ROS含量变化,并检测模型中凋亡和自噬蛋白表达水平变化。利用3-MA抑制细胞中的自噬发生后,再次检测H9c2细胞活性、LDH释放量,并用Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase3的表达,探究自噬在缺血及再灌注过程中所起到的作用。研究结果1.不同缺氧时间引起心肌细胞H9c2氧化损伤,同时激活细胞凋亡过程和细胞自噬途径,通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2,促进Bak和Bax活化激活细胞凋亡。2.在缺氧诱导H9c2细胞损伤过程中,miRNA-210显著上调。高表达的miR-210可以提高缺氧条件下的H9c2细胞的活性,抑制凋亡相关蛋白Caspase3及Bax、Bak的表达,并可以使抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调,从而对缺氧细胞起到一定的保护作用。低表达miR-210则会降低H9c2细胞在缺氧状态下的活性,加剧细胞损伤。3.BNIP3是直接受到miR-210调控的基因。BNIP3在H9c2细胞缺氧模型中升高,起到促凋亡的作用。抑制BNIP3的表达可以抑制H9c2细胞缺氧模型中的凋亡,并可以部分抵消miR-210低表达所造成的凋亡增加。另外,抑制BNIP3可以减少缺氧过程中自噬的发生。4.在H9c2细胞缺血-再灌注模型中,复氧过程细胞损伤程度较缺氧时加剧,且凋亡和自噬的水平均发生上调。在缺氧时抑制自噬H9c2细胞活性升高,细胞内自噬的发生对细胞存活不利。而在缺血再灌注过程中,细胞的凋亡和自噬的发生更加剧烈,细胞自噬发挥了主导作用,被激活的细胞自噬通过抑制细胞凋亡信号通路发挥细胞保护作用,同时升高的miR-210也发挥了一定的细胞保护作用。结论在H9c2细胞缺血及缺血再灌注损伤模型中,凋亡及自噬的信号通路被激活。在细胞缺氧损伤过程中,miR-210通过抑制靶基因BNIP3进而抑制细胞凋亡及自噬信号通路,发挥细胞保护作用。而在缺血再灌注过程中,被激活的细胞自噬通过抑制细胞凋亡信号通路发挥细胞保护作用,同时升高的miR-210也通过抑制凋亡发挥了一定的细胞保护作用。创新点及研究意义本研究首次证实了心肌细胞缺血及再灌注阶段过程中自噬对细胞活性及凋亡途径的不同影响,以及miR-210在此过程中对凋亡和自噬的调控,并进一步发现了miR-210通过抑制BNIP3的蛋白表达来发挥细胞保护作用。本研究为心血管疾病缺血再灌注损伤发生机制以及自噬在其中的作用的研究提供了新的理论支持,为miR-210在缺血再灌注损伤中的保护作用提供理论基础,为心血管疾病缺血再灌注损伤的临床治疗和预防提供了新的思路。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54;R-332
【图文】：

缺血再灌注损伤,机制,程序性细胞死亡,多种机制

吉林大学博士学位论文中释放，内皮血管舒张功能障碍，毛细血管内皮屏障破坏，中性粒离和活化，以及促血栓形成的过程[5]。最终，I/R 损伤的多种机制相导致蛋白质、脂质、碳水化合物代谢紊乱和细胞 DNA 的损伤。如果，这些损伤将导致坏死和程序性细胞死亡（图 1.1）。

模式图,细胞损伤,缺血再灌注,模式

图 1.2 缺血再灌注时细胞损伤模式[6]不同的组织和器官对 I/R 的易感性不同，这是由于各个组织对基础代谢需求不同而产生的。对于心肌组织来说，在人和动物模型中缺血约 20 分钟后开始出现不可逆损伤。受影响的冠状动脉越早重新打开，对于存活的心肌细胞的挽救效果越好，一般建议在局部缺血发作后 2 小时内进行治疗，在 12 小时内干预具有有益效果[31]。另外还有研究证明，短暂的缺血预处理（<5min）会增强心肌对后续缺氧的抗性[32]。这一过程可能有赖于短暂无伤害缺氧过程中促细胞存活程序的激活。此项结果说明短暂的 I/R 能提高心脏组织对随后暴露于长时间缺血的损害的耐受性，使得缺血后损伤显着降低。因此，对于缺血再灌注的研究，迄今依然有待进一步完善。1.2自噬

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