高脂饮食诱导的脂肪组织白色化对小鼠生精微环境的影响及其调控机制研究

发布时间：2020-06-23 12:56

【摘要】：目的:研究高脂饮食诱导的肥胖对小鼠生精微环境的影响以及白色化脂肪组织与小鼠生精微环境的信息交流机制。方法:建立高脂肪饮食诱导的肥胖疾病小鼠模型,利用(hematoxylinand eosin,HE)染色方法检测饮食诱导的肥胖对小鼠睾丸形态的影响,利用(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测肥胖小鼠睾酮以及(anti-Mullerian hormone,AMH)、(glialcellline-derived neurotrophic factor,GDNF)、(Inhibin,INH)的分泌。利用mRNA测序寻找肥胖小鼠与对照小鼠脂肪组织的差异基因。利用定量PCR,ELISA和(immunohistochemistry,IHC)等方法确定差异表达基因为脂肪细胞因子。在细胞水平上,通过定量PCR,WB,ELISA的方法验证脂肪细胞因子clusterin和resistin对TM3和TM4细胞分泌功能的影响。利用免疫共沉淀和免疫荧光的方法确定clusterin和resistin的相互作用受体,并利用si-RNA和小分子抑制剂处理TM3和TM4细胞,证明clusterin和resistin通过其相应的受体发挥功能。在体内水平,通过睾丸曲细精管显微注射的方法将clusterin和resistin注射到小鼠睾丸内,检测其对小鼠睾丸间质和支持细胞功能的影响。结果:高脂饮食诱导12周后,与正常饮食的对照组相比,肥胖小鼠体重增加,胰岛素、血糖、血脂等生化指标升高,炎症因子水平增加。睾丸体积减小,精子数目降低。HE染色结果显示肥胖小鼠睾丸生精小管直径减小,生精上皮厚度变薄。ELISA结果显示肥胖小鼠血清(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)、(luteinizing hormone,LH)、睾酮以及AMH、GDNF、INH的含量降低,雌二醇水平升高。定量PCR和WB结果显示合成睾酮的关键基因和转录因子P450scc(cytochrome p450 cholesterol side chain lyase)、P450c17(cytochrome p450 17α-hydroxylase)、StAR(steroidogenic acute regulatory protein)和 Nur77 的表达水平降低,Amh、Gdnf、Inha基因的表达水平也降低。肥胖和正常对照小鼠脂肪组织mRNA测序结果显示在肥胖小鼠的附睾白色脂肪组织eWAT(epididymal white adipose tissue)和腹股沟白色脂肪组织 iWAT inguinal white adipose tissue(inguinal white adipose tissue)中 clusterin和resistin的表达水平显著降低。通过定量PCR,ELISA的方法检测结果可知clusterin和resistin是由脂肪组织分泌的脂因子。分别用两种脂因子处理TM3和TM4细胞,定量PCR和WB结果结果显示这两种脂因子都抑制了 TM3细胞合成睾酮的基因P450scc、P450c17、StAR和Nur77的表达和睾酮的分泌。同时,这两种因子还抑制了 TM4细胞Amh、Gdnf、Inha基因的表达以及蛋白的分泌。免疫共沉淀和免疫双荧光的结果显示 VLDLR(very low density lipoprotein receptor)和 TLR4(Toll-like receptor 4)分别是 clusterin 和 resistin 在 TM3、TM4 细胞中的受体。clusterin 和 resistin睾丸曲细精管显微注射结果显示,在体内条件下,clusterin和resistin的注射导致小鼠睾丸体积变小,HE结果显示睾丸曲细精管生精上皮细胞严重脱落。同时通过定量 PCR,WB 的结果显示睾丸中 P450scc、P450c17、StAR、Nur77 和 Amh、Gdnf、Inha 以及 Jam(junctional adhesion molecule)、Zo-1(Zonula occludens)、Cldn11和Ocln的表达降低,ELISA结果显示睾酮和AMH、GDNF、INH的分泌减少。结论:高脂饮食诱导的肥胖小鼠睾丸减小,精子数目降低。高脂诱导的白色化脂肪组织通过分泌的clusterin和resistin抑制小鼠睾丸间质细胞睾酮的分泌和支持细胞AMH、GDNF、INH的分泌,从而破坏小鼠睾丸的生精微环境,导致睾丸和精子数目减少。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R589.2;R-332
【图文】：

增殖和存活，而（ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ邋ｆａｃｏｒ－１，ＣＳＦ－１）特异性地影响体外ＳＳＣｓ自我更新逡逑的过程而不影响原始精原细胞的增殖。相反，体外暴露于神经调节蛋白和（ｂｏｎｅ逡逑ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ４邋，邋ＢＭＰ４）会促进了ＳＳＣｓ的分化（如图２）。然而，最近的逡逑证据表明支持细胞在建立小鼠睾丸ＳＳＣｓ微环境中起主要作用，通过协调其他体细胞逡逑群共同实现这项功能［５］。逡逑３．邋Ｓｅｒｔｏｌｉ细胞及分泌的细胞因子逡逑Ｓｅｒｔｏｌｉ细胞将生精小管分成基底隔室，该基底隔室主要包括精原细胞和腔内隔逡逑１１逡逑

反应影响［２９］；还可作为再生医学的新型细胞来源。来自中胚层的Ｓｅｒｔｏｌｉ细胞可以逡逑转化为多功能神经干细胞，这表明支持细胞在基于细胞的治疗和组织工程中具有很逡逑大的应用价值（如图３所示）。在精子发生过程中，成体支持细胞主要通过分泌各逡逑种生长因子和细胞因子来调节ＳＳＣｓ的自我更新，分化和凋亡。睾丸支持细胞可以逡逑通过旁分泌途径控制ＳＳＣｓ的去分化过程［３０］。逡逑１２逡逑

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1 姜肋

本文编号：2727364