T-006对学习记忆障碍模型动物学习记忆障碍的改善作用及其机理研究

发布时间：2020-06-24 14:48

【摘要】：研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种慢性中枢神经系统退行性疾病,具体病理特征表现为老年斑、神经原纤维缠结及神经元数目减少,其主要临床特征包括记忆力减退和认知功能障碍[1]。目前关于阿尔兹海默病的发病机制尚不清楚,诸多证据表明,Aβ沉积被认为是阿尔兹海默病最重要的致病因素。“Aβ蛋白级联假说”认为,β淀粉样蛋白(Aβ蛋白)在AD发生时会异常沉积,引发包括神经元兴奋性毒性、神经炎症、tau蛋白高度磷酸化等一系列细胞级联反应,并作用于神经元和神经胶质细胞,最终导致神经元功能异常或数量减少,引起一系列精神症状[2,3]。目前国内外批准用于AD治疗的药物多为胆碱酯酶抑制剂,代表药为多奈哌齐,其主要通过抑制乙酰胆碱酯酶活性而抑制乙酰胆碱降解,增加局部乙酰胆碱浓度,从而改善神经递质传递功能。但多奈哌齐只针对轻、中度AD,随着病程发展,功能完整的胆碱能神经元数量减少,多奈哌齐的作用也会随之减弱。因此,开发治疗AD的新型药物十分重要。川芎嗪(TMP)来源于中药川芎的干燥根茎,具有抗炎、抗氧化和抑制细胞凋亡等多方面药理作用,但生物利用度不高[4]。J147是近几年由美国索克生物研究所合成的新型化合物,具有保护神经突触功能的作用[5]。T-006是我们将TMP分子连接到J147上,经过结构修饰而得到的新型化合物,前期体外实验证明,T-006在应激细胞模型中可表现出显著的抗氧化应激作用,可保护神经细胞免于损伤[4],提示该化合物有可能成为治疗AD的新型药物。本研究采用东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍模型和大鼠Aβ1-42侧脑室注射模型,研究了T-006对模型中动物学习记忆障碍的改善作用,并对其可能机制进行初步探讨。研究目的本研究在东莨菪碱致学习记忆障碍小鼠模型和SD大鼠侧脑室注射Aβ1-42模型上,观察T-006对老年痴呆模型动物学习记忆的影响,并探讨其可能机制。实验方法1.动物饲养雄性SD大鼠40只,SPF级,体重(200±20)g,由广东省医学实验动物中心提供,许可证号SCXK(粤)2013-0002。动物饲养于SPF级屏障环境动物室中,自由进食饮水。雄性KM小鼠72只,SPF级,体重(20±2)g,由南方医科大学实验动物中心提供,许可证号SCXK(粤)2011-0015。动物饲养于SPF级屏障环境动物室中,自由进食饮水。2.侧脑室注射将大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 ml·kg-1)麻醉,固定于脑立体定位仪上,参照George PaxinosCharles Watson大鼠脑立体定位图谱确定注射点坐标,坐标为:前囟后0.96 mm,中线旁开2.00 mm,深度4.00 mm。使用5μl微量进样器于注射点匀速缓慢注射5μl Aβ1-42,注射时间5min,完毕后留针10min以保证Aβ1-42充分扩散,随后,缓慢撤针后缝合,碘酒消毒创口。3.Morris水迷宫实验(Morris water maze)水迷宫装置由圆形水池和视频采集系统组成。水池内壁黑色,等分为I、II、III、IV4个象限,在IV象限(目标象限)中心放置一黑色平台,藏匿于1cm的水面之下。水迷宫系统自带恒温设备,使实验时水温保持在(22±2)℃。水迷宫实验由两部分组成:定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验持续四天,每天每只动物训练四次,分别从四个象限的入水点放入水中进行训练。实验时动物入水时同时启动视频采集系统,限时90s,若动物在90s内找到平台并在其上停留20s以上的,直接取出放回原鼠笼;若动物在90s内找到平台但没有在其上停留10s或90s内未能找到平台的,将其轻轻引导至平台并停留20s,再将其放回原鼠笼。正式训练期间记录每只动物从入水到找到平台所需时间。定位航行实验结束后第二天进行空间探索实验。实验时撤去平台,将动物从II象限入水点放入水中,同时启动视频采集系统,限时90s。评价指标:(1)动物从入水开始到第一次穿越原平台位置的时间,即潜伏期;(2)穿越原平台位置的次数;(3)动物在目标象限的游泳路程和时间;(4)每组平均游泳速度,反映动物的体力。4.高架十字迷宫实验(Elevated plus maze)高架十字迷宫放置于房间的一角,实验时保持安静,室温24℃左右。测试时将每只小鼠头部正对其中一个开放臂放入迷宫的中央平台处,同时打开轨迹记录和分析软件开始记录行为学各项指标其自由探究,探究时间限时5 min,观测人员同时在距离迷宫1.5 m处观察记录动物的活动状况。评价指标:(1)开放臂活动路程,记录应以小鼠四个爪子均进入到臂内为准,若有一个爪子退出则为走出该臂;(2)进入开放臂时间百分比;(3)进入四臂总次数,反映小鼠的体力。5.避暗梭箱实验(Passive avoidance assay)实验共进行2天,第1天进行适应性训练,将小鼠背对着中间隔板的方向放入明室,并开始计时5min并打开电击装置使小鼠进入暗室便能遭受点击,让其自由穿梭明暗室后停留,并记录其进入暗箱的反应潜时间和穿梭次数,5 min不进入者则剔除;第3天进行记忆保持检测:用同样方法将动物放入明室,限时5min,但不给予足底电刺激,观察其第一次进入暗箱的反应潜伏期和错误次数(进入暗箱次数)。6.乙酰胆碱酯酶活性测定(Ach E activity)行为学实验结束后,立即对动物进行麻醉,以冰冷生理盐水灌流后将动物断头取脑、分离海马。将海马称重,加入重量9倍的蛋白裂解液,制备脑组织匀浆,随后以10000×g离心30 min,取上清,放-20℃冰箱保存。根据Sigma Ach E活性测试盒说明书测定乙酰胆碱酯酶活性,用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。7.SOD、GSH和MDA活性测定行为学实验结束后,立即对动物进行麻醉,以冰冷生理盐水灌流后将动物断头取脑、分离海马。分别按海马重量加9倍蛋白裂解液制备脑组织匀浆,10000×g离心30 min,取上清于-20℃冰箱保存。分别根据南京建成生物工程研究所提供的SOD活性测试盒说明书、GSH含量测试盒说明书和MDA含量测定说明书,测定SOD、GSH及MDA含量,用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。8.免疫印迹法(western blotting)使用BCA蛋白定量试剂盒对组织匀浆上清液进行蛋白定量,将含30μg蛋白的样品制样后于90℃水浴5min变性,SDS-PAGE电泳分离后,电转印至PVDF膜上,脱脂奶粉封闭,加入检测蛋白相应一抗,4℃孵育过夜。用TBST洗膜后加入HRP标记的二抗,室温孵育,洗膜后用ECL显影液显影,曝光,使用Image J灰度分析软件进行灰度扫描分析,以β-tubulin为内参对照,结果以目的蛋白表达的灰度值与β-tubulin灰度值比值表示。结果1、行为学实验显示,T-006可明显改善动物的学习记忆能力,其改善作用与阳性药物多奈哌齐相当。2、乙酰胆碱酯酶活性测定结果显示,T-006可降低动物海马乙酰胆碱酯酶活性,提示T-006可以通过降低乙酰胆碱酯酶活性来改善学习记忆能力。3、SOD、GSH和MDA测定结果显示,T-006可降低动物海马MDA含量,升高SOD和GSH含量,改善脑内氧化还原状态,效果优于多奈哌齐。4、免疫印迹的结果显示,T-006可以升高海马神经突触蛋白含量;不同程度的降低Aβ1-42诱导的磷酸化tau蛋白过表达,并降低热休克蛋白含量,而多奈哌齐不能起到类似作用。结论T-006具有多方面药理作用,是一种具有前景的多靶点AD治疗新药,具体可以通过:1、加强中枢胆碱能系统活性改善痴呆模型动物学习记忆能力;2、抗氧化应激作用保护脑内神经元细胞损伤,从而达到改善痴呆模型动物的学习记忆能力;3、可清除脑内异常过度磷酸化tau蛋白和增多的热休克蛋白,从而达到改善痴呆模型动物的学习记忆能力;4、提高脑内神经突触蛋白表达水平,提高突触可塑性,改善痴呆模型动物的学习记忆能力。
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R965;R-332
【图文】：

TMP，J147，T-006化学结构图

侧脑室注射区域（蓝色LV区域即为lateralventricle侧脑室）

本文编号：2728004