顺乌头酸脱羧酶IRG1调控病毒增殖的效应及其机制研究

发布时间：2020-06-26 17:44

【摘要】：顺乌头酸脱羧酶IRG1是定位于线粒体中的一种代谢酶,其以三羧酸循环中的中间产物顺乌头酸为底物催化产生衣康酸。衣康酸属于三羧酸循环中的支线产物,虽然不进入主线的循环活动中,却影响着整个线粒体代谢状态,诱发一系列生理生化效应。衣康酸特殊的化学结构使其具有强烈的亲电子性质,能够与蛋白质半胱氨酸残基、谷胱甘肽等多种靶点相互结合形成特殊的化学修饰,进而完成一系列精细的调控活动,往往引起功能元件的失能。近年来发现IRG1-衣康酸在炎症调节、病原体感染和代谢相关疾病等方面具有重要功能。而IRG1-衣康酸在病毒感染过程中所发挥的功能鲜有被报道,我们推测IRG1-衣康酸所引起的代谢状态和基因表达谱的变化,以及一些未知的调节活动很可能影响着宿主与病毒之间的相互作用。为了认识IRG1-衣康酸与病毒之间的关系,我们展开了以下研究。第一部分IRG1促进VSV病毒增殖的效应我们前期转录组测序结果显示IRG1是病毒感染后表达上调最为显著的代谢相关分子之一,后续我们研究发现IRG1对病毒增殖具有调控效应并展开了机制研究。首先我们对IRG1作为病毒诱导基因的性质进行验证,发现确实多种病毒感染都能够快速、强烈的诱导IRG1表达。通过RNA干扰技术和IRG1敲除细胞对IRG1在病毒感染中的功能进行了分析,结果表明,不同于IRG1通过调控I型干扰素影响HSV病毒的增殖,IRG1能够通过I型干扰素非依赖的途径促进VSV病毒的增殖,即IRG1缺失能够显著减少VSV病毒在细胞中的RNA含量和上清中的滴度,同时伴随着更低的I型干扰素表达。在小鼠体内VSV感染模型中,IRG1全身性敲除小鼠各组织脏器中VSV病毒的RNA含量以及病毒载量显著低于野生型小鼠,但同时血清中细胞因子的含量也更低。此外,在IRF3敲除细胞中干扰IRG1依然能够抑制VSV病毒的增殖,提示IRG1对病毒增殖的促进作用不依赖于I型干扰素相关效应。最后,我们还证明IRG1稳定过表达细胞系中VSV病毒具有更强的增殖能力,也分泌更高水平的I型干扰素。第二部分IRG1通过代谢产物衣康酸促进VSV病毒的增殖我们关注到IRG1的代谢产物衣康酸,探究其是否在IRG1促进VSV病毒增殖中发挥作用。通过衣康酸衍生物DMI和OI我们对衣康酸的功能进行了研究,发现同时给予IRG1干扰组以及对照细胞过量的DMI或OI处理能够消除IRG1缺失引起的VSV病毒增殖的减弱,在IRG1缺失的骨髓来源巨噬细胞(Bone Marrow Derived Macrophages,BMDMs)和MEF细胞中同样获得了相同的结果。进一步研究表明,DMI和OI能够通过I型干扰素及下游通路非依赖的途径促进VSV病毒的增殖,且这种效应也广泛适用于上皮细胞。即DMI和OI处理能够显著促进细胞中VSV病毒RNA的含量,同时在IRF3或IFNAR1缺失的细胞中同样存在相同的促进效应。在体内VSV感染模型中,给予小鼠DMI或OI的预处理能够显著增加组织脏器中VSV病毒RNA的含量及血清中I型干扰素的浓度。我们还发现DMI和OI促进VSV病毒内吞和胞内复制两个环节。即DMI和OI处理能够促进VSV病毒感染1小时的病毒进入量,而在IRG1缺陷的细胞中病毒的进入量则减少;我们通过转染病毒RNA绕过病毒内吞环节,DMI和OI依然正调了胞内VSV病毒RNA的含量,相同感染方式下,IRG1缺陷细胞中病毒RNA的含量减少。以上结果说明IRG1-衣康酸对VSV病毒增殖的促进效应作用于病毒生命活动的多个环节。第三部分IRG1-衣康酸促进VSV病毒增殖的机制研究我们进一步对IRG1-衣康酸促进VSV病毒增殖的潜在机制进行了分析。已知IRG1-衣康酸可通过抑制琥珀酸脱氢酶(SDH)、促进Nrf2介导的基因转录和调控活性氧簇ROS的产生等途径发挥功能,因此我们首先对以上机制进行探索和排除。针对SDH的作用,我们发现在体外和体内实验中使用琥珀酸脱氢酶经典抑制剂DMM处理并不显著影响VSV病毒的增殖。此外,DMM也不会影响DMI和OI对VSV病毒增殖的促进效应,表明衣康酸并不通过SDH发挥功能。针对Nrf2的作用,我们在干扰Nrf2之后再使用DMI和OI处理细胞,发现干扰Nrf2之后并不会对DMI和OI的效应产生影响,表明IRG1-衣康酸也不通过Nrf2发挥效应。针对ROS的产生,我们的研究表明,DMI和OI处理能够抑制细胞本底ROS的产生,但是进一步研究发现清除细胞中的ROS之后,并不会影响DMI和OI对病毒增殖的效应,表明IRG1-衣康酸并不通过ROS发挥效应。据此,已知IRG1-衣康酸发挥作用的三条主要途径均被排除。为了寻找IRG1-衣康酸促进VSV病毒增殖的关键机制,我们对IRG1敲除以及对照细胞进行了RNA-seq转录组测序,在差异基因的富集结果中我们发现,IRG1敲除之后会引起大量氧化磷酸化及脂质代谢相关基因的变化。对氧化磷酸化进一步分析显示,衣康酸能够促进氧化磷酸化相关基因的上调表达,细胞内的ATP含量也明显升高。ATP抑制剂处理能够部分逆转DMI和OI的效应;干扰介导电子传递链基因表达的转录因子之后,虽然抑制了VSV病毒的增殖,但却不能完全消除DMI和OI引起的病毒增殖差异。以上结果表明能量代谢的上调可能在衣康酸促进VSV病毒增殖的效应中起到一定的辅助作用,但并不是主导因素。另一方面,我们分析了脂质代谢在IRG1-衣康酸促进VSV病毒增殖过程中是否发挥作用。首先,抑制脂质代谢相关基因的转录能够减弱DMI和OI的效应,而抑制胆固醇合成后几乎完全阻断了DMI和OI对VSV病毒增殖的促进作用,因此我们关注了胆固醇合成过程中发生的变化。胆固醇合成通路上主要产生类胆固醇和类异戊二烯两类脂质物质,且都与病毒增殖具有一定相关性。我们进一步研究发现,胆固醇及其衍生物并未参与调控VSV病毒的增殖,而产生类异戊二烯物质-双r{牛儿焦磷酸(GGDP)的支线代谢通路可能发挥关键作用。外源补充GGDP能够逆转抑制胆固醇合成之后DMI和OI效应的丧失,说明衣康酸发挥功能的环节处于GGDP下游。GGDP能够介导特殊的代谢修饰异戊烯化,往往对病毒的增殖具有正向调节作用。使用异戊烯化抑制剂能够显著阻断DMI和OI对病毒的效应,说明衣康酸的效应极大程度依赖于异戊烯化。通过对异戊烯化过程中相关功能酶的定量检测发现,DMI和OI能够显著促进这些基因的表达,同时异戊烯化介导的小GTPase的膜转位活动也显著增强。综上所述,在病毒感染时IRG1能够被快速且强烈的诱导表达,通过其代谢酶活性催化产生大量的衣康酸,衣康酸通过调节氧化呼吸以及异戊烯化相关基因的高表达,提高细胞内ATP的含量,正调异戊烯化修饰的生化活动,两方面共同促进了VSV病毒在宿主中的增殖。本课题对IRG1-衣康酸在病毒感染中的作用及其机制上提出了新的认识,进一步揭示了IRG1-衣康酸发挥效应的方式,也为临床上相关疾病的治疗提供新的靶点和思路。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373
【图文】：

转录组,病毒感染,测序,顺乌头酸

顺乌头酸脱羧酶 IRG1 调控病毒增殖的效应及其机制有明显变化的代谢相关分子，我们对 VSV 和 HSV 病毒感染前后的 BMD组测序分析。VSV 病毒属于单股负链 RNA 病毒，HSV 属于双链 DNA 病序结果，有 32 个代谢相关基因在两种病毒感染后表达都显著上调，有 11关基因在两种病毒感染后表达都显著下调（图 1-2 A），我们选取了其中显的 10 个基因作为候选分子（图 1-2 B，C），通过 RNA 干扰实验探究染中的潜在效应。其中，基因 Acod1 引起了我们的关注，其在两种病毒刺表达极为显著（图 1-2 B，C）。基因 Acod1 也称作 Irg1，是顺乌头酸脱编码基因，我们实验室前期研究发现 IRG1 能够通过调控 ROS，发挥炎[43]。除此之外，我们课题设计初期关注于抗病毒天然免疫信号通路中关键AVS[41]的相互结合蛋白。通过免疫共沉淀和质谱技术，我们对 MAVS 的白进行了鉴定，其中发现 IRG1 与 MAVS 之间存在潜在的相互结合关系，提示 IRG1 可能在病毒感染过程中具有潜在的功能。

病毒感染

无论是 RNA 病毒（VSV 和 Sev）还是 DNA 病毒（HSV，VACV）都能够在腹腔巨噬细胞（PeritonealMacrophages,PMs）中诱导 IRG1 高表达（图 1-3A）。我们又对病毒感染后 IRG1 基因表达的动态变化进行了检测，以 VSV 感染为例，在病毒感染约 1 小时的时候 IRG1 的表达就明显上调（图 1-3B），说明 IRG1 对于病毒感染的应答是极其迅速的。而已有文献报道包括 I 型干扰素在内的多种细胞因子都能够诱导 IRG1 的表达[37, 43]，因此我们也同时检测了 Ifnb1 和 Il6 的表达。有趣的是，IRG1 在病毒感染早期的高表达明显提前于 I 型干扰素以及炎性因子 Il6 的表达（图 1-3B），因此我们推测 IRG1 可能在病毒感染早期独立于 I 型干扰素信号发挥着一定的作用。在体内实验中，我们首先检测了在非病毒感染状态下 IRG1 在各组织脏器中的表达分布情况，如图（图 1-3C）所示，IRG1 广泛表达于各个组织脏器中，其中肝脏中的表达明显高于其他脏器。进一步，我们检测了在 VSV 和 HSV 病毒感染下 IRG1 在组织中的表达情况，结果显示（图 1-3D，E），在 VSV 和 HSV 病毒感染 12 小时的时候肺脏、肝脏和脾脏中的 IRG1 明显高表达，24 小时时则恢复到感染前的表达水平。上述 IRG1 表达情况表明 IRG1 在各组织脏器中广泛表达，且病毒感染能够强烈且迅速的诱导 IRG1 的表达，提示其很可能在病毒感染过程中发挥着一定的功能。

【相似文献】