转录因子MAZ及SP1对C1orf109基因转录表达调控的体外研究

发布时间：2020-06-26 09:37

【摘要】：目的:本文旨在研究体外条件下,转录因子myc相关锌指蛋白(myc-associated zinc finger protein,MAZ)及SP1对人类1号染色体开放阅读框109(C1orf109)基因的转录表达调控。该研究的目的是回答以下问题:是否存在SP1之外的转录因子调节C1orf109基因的表达;C1orf109的表达是否受其产物磷酸化状态的反馈调节;C1orf109的表达是否存在另外的转录产物。方法:体外条件下,凝胶电泳迁移实验(EMSA)鉴定C1orf109基因启动子上MAZ和SP1的顺式作用元件,包括突变寡核苷酸的竞争反应和特异性抗体超迁移实验;为了研究MAZ和SP1对C1orf109启动子的有效性,我们将C1orf109基因上游2.5kb的片段亚克隆到(绿色荧光)EGFP表达载体中,并且测序验证构建的载体;利用Lipofectamine ~(TM)3000 Reagent在不同条件下,用C1orf109启动子驱动的不同载体转染Hela细胞;转染24h后,流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测EGFP的表达情况;找到新的转录子后,将C1orf109启动子区和新转录子序列亚克隆到EGFP载体上;实时定量PCR(RT-PCR)用于检测结果是否在转录和翻译水平上是否一致,并且检测由C1orf109启动子驱动的两种转录子。结果:1.MAZ在C1orf109启动子区有结合位点,且MAZ与SP1有共享结合位点的情况[1]。2.转录因子MAZ和SP1均抑制基因C1orf109的转录表达,且SP1的抑制作用强于MAZ,MAZ和SP1对C1orf109的抑制作用机制表现复杂~([1])。3.特异性抑制MAPK磷酸化途径,转录因子MAZ和SP1对调控C1orf109的转录表达未见影响。4.体外条件下,选择性抑制CK_2激酶的活性影响C1orf109的转录表达。5.C1orf109启动子区和新的转录子驱动的绿色荧光报道载体转染Hela细胞后检测到绿色荧光蛋白的表达,表明C1orf109的表达可能有新的转录子。6.初步的RT-PCR结果显示,分别用构建的C1orf109两种表达载体转染Hela细胞后,mRNA表达水平均增高。结论:MAZ与SP1两个转录因子共调控C1orf109在生理及病理条件的表达,调控方向一致,这种冗余机制调控方式的存在提示该基因的精确表达调控对于细胞行使其生物学功能具有重要意义~([1]);且MAZ和SP1对C1orf109转录表达的调控是一种复杂且重要的机制。选择性抑制CK_2激酶的活性影响C1orf109的转录表达,其表达可能与CK_2激酶的磷酸化之间存在反馈作用。C1orf109的表达可能有新的转录产物。初步的RT-PCR结果为是否成功构建C1orf109表达载体提供重要数据参考。总之,以上工作为进一步探究C1orf109基因新产物的作用及C1orf109异常表达引起肿瘤的病理机制提供理论基础。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R346
【图文】：

示意图,实验思路,示意图,序列合成

图 2-1 实验思路示意图图 2-1，利用 PROMO 软件（版本 3.0.2）对 C1orf109 基因转录起始点上p～-1bp 的 DNA 序列进行转录因子结合位点预测，筛选出可疑序列合成探针 EMSA（包括竞争实验、超迁移实验）分析是否有 MAZ 结合点，MAZ、S

示意图,启动子,主要结构,荧光

图 2-3 MAZ 启动子驱动的荧光报告载体主要结构示意图2. Xba1+EcoR1 酶切 MAZ 启动子驱动的荧光报道载体，去掉 MAZ 基因的启动区序列，注意 37℃酶切 30min 左右，以保证产物酶切完全；3. 上述 2 中酶切终产物琼脂糖凝胶电泳分离后，胶回收需要片段，测浓度 4℃保备用；4. 将定制的 yp-96 连入酶点 PF 及 yp-97 连入酶点 PR 合成双链，与上述 3 中的回收产物用 T4 连接酶 16℃水浴过夜连接；5. 将连接体系全部转化进制备好的大肠杆菌感受态细胞，放入 SOC 培养基，37℃，00r/min 水浴扩增 1.5h 左右后，收集细菌；6. 分别将每个样品在 LB-Amp 固体培养基涂板，放细菌培养箱中，37℃培养 8h，以筛选 Amp 抗性的菌落；7. 上述 6 中的每个样品板都需挑取 3-5 个单克隆，LB-Amp 液体培养基 37℃，200r/min 水浴培养过夜，质粒提取试剂盒提取质粒后酶切+琼脂糖凝胶电泳验证，

【参考文献】