D型流感病毒反向遗传系统的构建及其HE基因免疫原性的研究

发布时间：2020-06-30 07:16

【摘要】：D型流感病毒是新定义的流感病毒家族的一员,于2011年首次从疑似患流感的猪体内分离获得,自2014年以来在世界各地的牛体内被发现,其主要宿主包括猪、牛和其他小反刍动物等。此外血清学证据也证明了D型流感病毒具有感染人类的可能性。同时该病毒也被认为与牛的呼吸道疾病有着密切的关系。HEF蛋白是D型流感病毒表面唯一的糖蛋白,决定其感染特性。因此对D型流感病毒基因特性以及HEF蛋白免疫原性的研究为预防D型流感病毒起到了重要作用。本研究首次尝试构建了D型流感病毒的反向遗传操作平台,并且利用昆虫细胞杆状病毒系统构建了可以作为D型流感病毒有效诊断抗原的HEF蛋白重组杆状病毒,并利用DNA免疫小鼠获得了抗HEF蛋白血清。实验主要分为两大部分,第一部分是:应用A型流感病毒的十三质粒反向遗传系统的pHH21和pCAGGS载体,通过分子克隆等手段构建了D型流感病毒的十二质粒反向遗传操作平台;同时依据广泛应用于A型流感病毒的八质粒反向遗传系统的pBD载体,构建了D型流感病毒的七质粒反向遗传系统。分别将两套系统的重组质粒通过共转染到293T细胞中,并将质粒转染的293T细胞上清液对细胞以及豚鼠进行感染,通过Real-time RT-PCR方法以及电镜观察对拯救病毒进行鉴定。第二部分是:首先利用杆状病毒载体构建了重组HEF蛋白的杆状病毒系统,通过红细胞凝集试验以及Western Blotting试验鉴定HEF蛋白的免疫原性。同时应用pCAGGS载体构建了用于小鼠DNA免疫的高效表达HEF蛋白的重组质粒,并通过与CpG-ODN分子佐剂进行联合免疫获得了相应的抗HEF蛋白血清,并通过血凝抑制试验进行抗体效价的检测。研究结果:(1)成功地构建了D型流感病毒的十二和七质粒反向遗传系统;(2)通过七质粒反向遗传系统共转染293T细胞成功获得特异性病毒粒子;(3)拯救的病毒不能够感染A549、MDCK、ST细胞,可在豚鼠的上呼吸道中进行少量的复制拷贝,但感染效力较低;(4)成功地构建了可以作为D型流感病毒诊断抗原的重组杆状病毒;(5)通过质粒与CpG-ODN分子佐剂联合免疫小鼠制备了具有较高血凝抑制效价的抗HEF蛋白血清。
【学位授予单位】：长春理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392;R373
【图文】：

谱系,遗传进化分析

293 份牛血清进行检测，发现其中 240 份血清的ninhibition，HI）抗体呈阳性（效价≥40），阳性率明 IDV 早在 2003 年就已经广泛存在。1~2016 年，在法国[7]、意大利[8,9]、墨西哥[10]、肯尼亚[个国家检测到了该病毒的存在。2016 年，Zhai 等[1 个农场中收集了 574 份样品，其中 324 份动物血清本。在230份鼻拭子样本中，奶牛的IDV阳性率为124/55），猪为 36.8%（7/19）。324 份血清样本检测中 7.8%（15/193），水牛为 5.9%（3/51），山羊为 33.8 也可以羊群之间进行传播。主要分为 D/OK（D/swine/Oklahoma/1334/2011）与 D/ 2013）两个谱系[2]（如图 1.1），HEF 蛋白的系统进化了一致性，特别是 HEF 蛋白的 212 位置上的氨基酸，而 D/660 谱系的 212 位置为精氨酸。中国目前仅发现发现的几株 IDV 均不属于这两个谱系。

示意图,简单结构,示意图,蛋白

左右；RNA 片段 3 编码的是聚合酶蛋白 3（polymerase 3，P3），为聚合酶 A（polymerase A，PA），大小约为 83 KD。PB2 和 PB1 而 P3 蛋白与其他流感病毒不同为中性。它们都是在病毒感染宿主主的细胞质中形成聚合酶复合体，随后这种复合体会被转运到宿主责催化、修饰病毒所需的基因组 RNA。PB1 蛋白的氨基酸序列被毒各片段中最保守的部分，经常用来评估流感病毒之间的进化关 PB1 蛋白氨基酸序列与其他流感病毒进行比较分析后，发现与 IAV1 蛋白的同源性约为 69%~72%，而与 ICV 的 PB1 蛋白同源性可达这表明 IDV 与 ICV 的亲缘性更近。NA 片段 4 主要负责编码 HEF 蛋白，大小约为 72 KD 左右。在 IAV血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）。与 IAV 和 IBV 不同，IDV 同只具有１个糖蛋白（如图 1.2），因此病毒包膜表面的突起见不到蘑白，HEF 蛋白可以诱导机体产生保护性抗体。HEF 蛋白主要是由 H 两个亚基组成[19]（如图 1.3），其中 HEF1 主要负责宿主细胞受体特EF2 主要参与细胞融合过程[20]。ab

【参考文献】