狂犬病病毒糖蛋白83和367位点突变株的拯救与鉴定
发布时间：2020-06-30 03:30
【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的人和多种动物中枢神经系统感染的急性传染病,临床发病后死亡率几乎达到100%。通过实验室先前的研究发现,狂犬病毒糖蛋白(G)的第83、367位氨基酸对细胞适应性及致病力至关重要。本研究以狂犬病毒SAD株为母本质粒,运用重叠延伸PCR和点突变试剂盒构建K83R-rSAD、P367S-rSAD和K83R-P367S-rSAD三个重组病毒全长质粒。成功拯救出包括SAD亲本株及以上三个重组病毒,将重组病毒在细胞上连续传代5代,测定F6代病毒的多步生长曲线,在第72 h和第96 h时病毒滴度达到最高,K83R-rSAD为10~(8.5)FFU、P367S-rSAD为10~(7.5)FFU、K83R-P367S-rSAD为10~(8.5)FFU、SAD为10~(7.0)FFU,结果表明狂犬病毒糖蛋白第83位氨基酸突变后,狂犬病毒的滴度显著升高。对重组病毒G基因测序结果表明K83R、P367S在连续五代内稳定遗传。Western Blot检测结果表明G83突变后,G蛋白表达量明显升高。将上述四株病毒以脑部注射的方式接种于昆明白乳鼠,乳鼠全部死亡。分离鼠脑病毒后,以肌肉注射的方式免疫C57BL/6小鼠,小鼠发病并有死亡现象。免疫SAD亲本毒的小鼠全部死亡,免疫重组病毒K83R-rSAD、P367S-rSAD和K83R-P367S-rSAD后小鼠的存活率分别为72%、42.6%和63.6%,结果表明狂犬病毒G83和G367突变后能够降低对C57BL/6小鼠的致病性。综上所述狂犬病毒糖蛋白83和367位氨基酸的改变能够降低对小鼠的致病性,同时第83位氨基酸改变后狂犬病毒糖蛋白表达量升高。本研究成功拯救出致病力更弱的重组狂犬病病毒,为今后研制狂犬病毒弱毒疫苗了奠定基础。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373
【图文】：
图 1.2 狂犬病病毒结构图[33]Figure 1.2 The Structure of Rabies Virus[33]的功能白都具有免疫原性，核蛋白 N 是由 450 个氨基白是狂犬病病毒的一种重要的保护性抗原，在不被 RNA 酶降解[34]。码高度亲水性的磷蛋白，并且 P 基因的 mRNAP1, 297 位氨基酸）和少量的 N 末端截短的 P酸序列分别对应于 P1 在 20 ~ 297、53 ~ 297、有拮抗肌肉细胞中的 IFN 诱导的功能，能够促神经，在病毒的侵袭中具有重要作用[35]。同时制 I 型干扰素的抗病毒作用。P 蛋白是附着在
图 1.3 狂犬病病毒反向遗学系统操作模式图Figure 1.3 The schematic diagram of rabies virus reverse genetic operation system狂犬病病毒的反向遗传学系统的建立与发展，不仅对研究狂犬病病毒的致病机理提供有效途径，而且能够协助研究狂犬病病毒的各个结构蛋白与功能之间的关系。实际操作中可以通过点突变、基因删除、插入、替换或重排 RABV 编码的五个基因来改变 RABV 的基因组，再通过反向遗传学获得重组病毒，进而研究影响 RABV 致病性的因素、病毒基因组与其功能之间的关系、基因组转录和复制的机制以及病毒与宿主之间的相互作用等，为探索 RABV 减毒疫苗的开发提供帮助。7 Overlap PCR 的原理与应用7.1 Overlap PCR 原理传统的基因克隆中，需要使用包含独特限制性酶切位点的特异性引物对靶基因进行 PCR
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373
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图 1.2 狂犬病病毒结构图[33]Figure 1.2 The Structure of Rabies Virus[33]的功能白都具有免疫原性，核蛋白 N 是由 450 个氨基白是狂犬病病毒的一种重要的保护性抗原，在不被 RNA 酶降解[34]。码高度亲水性的磷蛋白，并且 P 基因的 mRNAP1, 297 位氨基酸）和少量的 N 末端截短的 P酸序列分别对应于 P1 在 20 ~ 297、53 ~ 297、有拮抗肌肉细胞中的 IFN 诱导的功能，能够促神经，在病毒的侵袭中具有重要作用[35]。同时制 I 型干扰素的抗病毒作用。P 蛋白是附着在
图 1.3 狂犬病病毒反向遗学系统操作模式图Figure 1.3 The schematic diagram of rabies virus reverse genetic operation system狂犬病病毒的反向遗传学系统的建立与发展，不仅对研究狂犬病病毒的致病机理提供有效途径，而且能够协助研究狂犬病病毒的各个结构蛋白与功能之间的关系。实际操作中可以通过点突变、基因删除、插入、替换或重排 RABV 编码的五个基因来改变 RABV 的基因组，再通过反向遗传学获得重组病毒，进而研究影响 RABV 致病性的因素、病毒基因组与其功能之间的关系、基因组转录和复制的机制以及病毒与宿主之间的相互作用等，为探索 RABV 减毒疫苗的开发提供帮助。7 Overlap PCR 的原理与应用7.1 Overlap PCR 原理传统的基因克隆中，需要使用包含独特限制性酶切位点的特异性引物对靶基因进行 PCR
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