（一）重组Irisin蛋白诱导内皮细胞迁移和血管新生及其机制研究（二）二氢杨梅素对顺铂引起肾损伤的保护性作用及其机制研

发布时间：2020-06-29 23:34

【摘要】：研究背景:血管新生,是由已有的脉管系统中生成新的血管,这需要内皮细胞一系列的协调活动,例如增殖、迁移、结合形成血管样的管腔结构。这一过程是发生血管损伤后组织修复的关键步骤。已有多种疾病被证实可以引起脉管系统的损伤,最常见的有心血管疾病及慢性代谢性疾病,尤其是糖尿病的大血管及微血管并发症。因此,修复受损的内皮细胞,促进受损处的血管新生,在治疗多种疾病引发的血管损伤方面具有十分重要的意义。此前,已有大量关于内源性因素以及激素参与调节血管新生的报道。长期以来,大量研究表明适量有氧运动能够有效预防和延缓多种心血管疾病和慢性代谢性疾病的发生发展。2012年哈佛大学Spiegelman实验室的最新研究发现了一种新的肌肉因子—Irisin,Irisin是经蛋白水解酶切除Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白 5(fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5,FNDC5)的 N 端信号肽后形成的约110个氨基酸大小的可分泌多肽片段。作为运动和代谢之间的联系,Irisin被认为具有增加体能消耗,减少身体重量,以及增加小鼠的胰岛素敏感性等多种作用。在我们的前期研究结果中,我们阐明了 Irisin具有经由ERK信号通路促进人脐静脉内皮细胞增殖的作用,同时它能够部分性地保护细胞,使其免受高浓度葡萄糖诱导的内皮细胞凋亡。我们的这些发现表明,Irisin和血管内皮细胞之间存在一定的联系。然而,目前尚未有研究证明Irisin是否直接参与调节血管内皮细胞的其他功能,如迁移和血管新生,其中可能涉及的分子机制及信号传递系统也尚未可知。研究目的:1.体外实验部分旨在探讨重组Irisin蛋白对人脐静脉内皮细胞迁移及小管新生的影响,并探寻此过程可能会涉及到的分子机制及信号通路。2.体内实验部分旨在进一步证实重组Irisin蛋白对斑马鱼节间血管的血管新生存在促进作用。研究方法:1.重组Irisin蛋白的表达纯化;2.原代人脐静脉内皮细胞的分离提取与体外培养;3.通过细胞划痕实验和Transwell小室迁移实验检测重组Irisin蛋白对人脐静脉内皮细胞的迁移能力的影响;4.通过细胞新生管腔形成实验检测重组Irisin蛋白对人脐静脉内皮细胞的小管形成能力的影响;5.通过斑马鱼节间血管生成实验检测重组Irisin蛋白对斑马鱼损伤的节间血管新生能力的影响;6.通过实时定量荧光PCR检测重组Irisin蛋白处理后参与此过程的相关基因的表达情况;7.通过Western印迹分析检测重组Irisin蛋白处理后参与此过程的相关信号通路及基质金属蛋白酶的表达情况;8.通过明胶酶谱法检测重组Irisin蛋白处理后基质金属蛋白酶的活性;9.统计分析所得结果,采用t检验比较不同组之间的差异;采用单向方差分析(ANOVA)比较不同试验组之间的数据。P0.05的差异被视为有统计学意义。研究结果:1.Irisin促进人脐静脉内皮细胞的迁移:(1)细胞划痕实验结果显示,与对照组比较,在使用10nM和20nM两个不同浓度的重组Irisin蛋白处理细胞12和24 h的实验组中,人脐静脉内皮细胞的迁移速度明显加快,且表现出Irisin剂量依赖效应。(2)Transwell小室迁移实验结果显示,与对照组比较,在使用10 nM和20 nM两个不同浓度的重组Irisin蛋白处理24 h后,人脐静脉内皮细胞表现出显著增强的迁移能力,并同样表现出Irisin浓度依赖效应。2.细胞新生管腔形成实验结果显示,与对照组比较,10 nM和20 nM两个不同浓度的重组Irisin蛋白处理细胞6 h均能促进人脐静脉内皮细胞的小管形成,且重组Irisin蛋白浓度为20 nM组的小管形成数量和密度均更为明显。3.斑马鱼节间血管生成实验结果显示,重组Irisin蛋白能够减弱PTK 787化学诱导的斑马鱼节间血管损伤,并促使被抑制的节间血管重新生长。4.Irisin上调MMP-2以及MMP-9表达和活性:(1)实时定量PCR的结果表明,重组Irisin蛋白处理人脐静脉内皮细胞和斑马鱼24 h后,均能够显著刺激人脐静脉内皮细胞中MMP-2和MMP-9基因的表达,并略微降低TIMP-1基因的表达。(2)Western印迹结果显示,重组Irisin蛋白处理人脐静脉内皮细胞24 h后,MMP-2和MMP-9在蛋白水平表达也显著上调。(3)明胶酶谱分析处理后发现,重组Irisin蛋白可以增加人脐静脉内皮细胞分泌的MMP-2和MMP-9的活性。5.Irisin通过ERK信号通路调节人脐静脉内皮细胞的迁移和新生管腔形成:(1)Western印迹结果显示,经重组Irisin蛋白处理人脐静脉内皮细胞5 min及10 min的时间点,P-ERK的表达显著升高。(2)用ERK的特异性抑制剂U0126处理人脐静脉内皮细胞后,Irisin诱导的细胞迁移和管腔形成被显著抑制。6.ERK抑制剂对Irisin诱导的MMP-2以及MMP-9表达和活性的影响(1)Western印迹结果显示,U0126处理后,Irisin诱导的MMP-2以及MMP-9的表达被显著抑制。(2)明胶酶谱分析显示,U0126处理后,Irisin诱导的MMP-2以及MMP-9的活性同样被显著抑制。结论:1.重组Irisin蛋白能够促进人脐静脉内皮细胞的迁移及新生管腔形成。2.重组Irisin蛋白能够减轻PTK 787诱导的斑马鱼节间血管的损伤。3.ERK MAPK信号通路参与重组Irisin蛋白调节内皮细胞的功能及MMP-2/MMP-9的表达和活性。研究背景:顺式-二氯二氨合铂(Ⅱ)(cis-Dichlorodiamineplatinum(Ⅱ),临床称之为顺铂),属于铂类抗癌药物。它与多种抗肿瘤药物有协同作用,是多种实体肿瘤的一线化疗药物之一,常用于治疗头颈部癌、小细胞与非小细胞肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫内膜癌等多种鳞状上皮癌和恶性淋巴瘤。然而,顺铂在具有高效广谱抗癌活性的同时,也会对人体产生毒副作用,其中最主要的是其引起的剂量相关性肾脏毒性。严重时会引起不可逆性的肾功能障碍及肾小管坏死。目前顺铂引起肾毒性的具体病理机制尚未完全明确,但广泛认为,肾小管上皮细胞摄入顺铂后会引起细胞内氧化应激的激活和炎症因子的大量释放,这是导致肾小管上皮细胞坏死及肾脏组织损伤的主要原因。二氢杨梅素是从葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata,即藤茶)的叶片中提取出的主要活性成分,为天然黄酮类化合物。藤茶的茎叶被用于治疗感冒发热、咽喉肿痛等病症在我国已有数百年历史。以往的研究发现,二氢杨梅素具有多种药用功效,包括抗氧化和清除氧自由基的作用。有研究报道发现二氢杨梅素能够有效地减少抗癌药多柔比星(也称阿霉素)造成的大鼠原代心肌细胞的凋亡与活性氧的释放,从而缓解急性心肌毒性并部分恢复心脏功能。但尚未有研究证明二氢杨梅素对顺铂引起的肾毒性损伤是否同样有保护性作用。因此根据以往的研究结果,我们建立了顺铂诱导小鼠急性肾损伤的模型,观察二氢杨梅素对顺铂诱导的肾组织内炎症细胞浸润和氧化应激反应的抑制作用,以及二氢杨梅素对顺铂引起的肾小管上皮细胞HK-2凋亡及坏死的保护性作用。研究目的:1.观察二氢杨梅素对顺铂诱导的HK-2细胞凋亡和坏死的影响。2.建立顺铂诱导C57/BL6小鼠急性肾损伤模型,观察二氢杨梅素对小鼠模型的保护性作用,并探讨其中可能涉及的保护性机制。研究方法:1.WST-1和DAPI染色检测HK-2细胞的增殖抑制率和凋亡细胞数量;2.Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平3.建立顺铂诱导的C57/BL6小鼠急性肾损伤模型;4.检测小鼠血清肌酐和尿素氮水平;5.检测肾组织内氧化应激标志物的水平;6.PAS和HE染色观察肾组织的大体形态以及肾组织内中性粒细胞的浸润情况;7.免疫组织化学染色观察肾组织内DNA损害标志物的表达情况;8.TUNEL染色检测肾组织内凋亡细胞的数量;9.实时定量荧光PCR检测肾组织内炎症因子基因的表达水平;10.统计分析所得结果,每组实验至少重复3次。采用t检验比较不同组之间的差异;采用单向方差分析(ANOVA)比较不同试验组之间的数据。P0.05的差异被视为有统计学意义。研究结果:1.二氢杨梅素保护顺铂引起的HK-2细胞凋亡:(1)WST-1检测细胞存活实验结果显示,与顺铂单处理组相比,50μM二氢杨梅素共处理组细胞的增殖抑制率较低。(2)DAPI染色结果显示,与顺铂单处理组相比,50 μM二氢杨梅素共处理组的细胞凋亡数量明显减少。(3)Westernblot结果显示,与顺铂单处理组相比,二氢杨梅素下调了促凋亡蛋白Bax的表达,上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。2.二氢杨梅素缓解了顺铂导致的肾脏毒性:(1)检测不同组小鼠的血清尿素氮和血清肌酐结果显示,单次顺铂注射3天后血清尿素氮和肌酐均显著升高,而二氢杨梅素(500 mg/kg)与顺铂共处理组的结果有部分好转,并表现出二氢杨梅素浓度依赖效应。(2)PAS染色结果显示,顺铂单处理组小鼠肾小管出现明显的结构破坏和肾小管管型形成,而二氢杨梅素(500 mg/kg)与顺铂共处理组有明显好转。(3)TUNEL染色结果显示,与顺铂单处理组相比,二氢杨梅素共处理组TUNEL阳性胞核数目明显减少。3.二氢杨梅素对顺铂引起的氧化应激的保护性作用:(1)8-OHdG免疫组化染色结果显示,与顺铂单处理组相比,二氢杨梅素共处理组阳性胞核数目明显减少。(2)对肾组织内氧化应激标志物的检测结果显示,与顺铂单处理组相比,二氢杨梅素共处理组MDA的水平有所下降,而SOD、CAT的水平有所升高。4.二氢杨梅素抑制顺铂引起的炎症标志物的表达:(1)与顺铂单处理组相比,二氢杨梅素共处理组可以显著降低炎症因子IL-1β、TNF-α、MCP-1 的 mRNA 表达水平。(2)通过对HE染色中性粒细胞浸润情况的半定量评分分析发现,顺铂单处理组小鼠肾组织中的中性粒细胞浸润数目明显多于二氢杨梅素共处理组。结论:1.二氢杨梅素能够抑制顺铂诱导引起的HK-2细胞的凋亡。2.二氢杨梅素能够缓解顺铂导致的小鼠急性肾毒性。3.二氢杨梅素对顺铂引起肾毒性的作用与抑制氧化应激与炎症反应密切相关。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R363
【图文】：

细胞增殖,蛋白,对重,处理组

图１．丝裂霉素Ｃ邋（ＭＭＣ）对重组Ｉｒｉｓｉｎ蛋白引起的ＨＵＶＥＣ细胞增殖的抑逡逑制作用。ＨＵＶＥＣ细胞分为Ｈ组加入处理：①２０邋ｎＭ重组Ｉｒｉｓｉｎ蛋白处理组；②逡逑５邋ｎｇ／ｍｌ丝裂霉素Ｃ与２０邋ｎＭ重组Ｉｒｉｓｉｎ蛋白共同处理组；⑤５帖／ｍｌ丝裂霉素Ｃ逡逑处理组。分别处理细胞至６，１２，邋２４及４８邋ｈ，用ＭＴＴ法检测细胞存活率。ｎ＝３，逡逑巧邋＜０．０５。逡逑

划痕实验,蛋白,细胞的,细胞

图２．细胞划痕实验显示重姐Ｉｒｉｓｉｎ蛋白对ＨＵＶＥＣ细胞的ＨＵＶＥＣ细胞接种化６孔板上（１邋Ｘ邋１0６／孔），待细胞生长至融合右时，用无茜的一次性枪头（２００川）刮擦细胞形成横向的细细胞分为＾组加入处理：＠５邋ｎｇ／ｍｌ丝裂霉素Ｃ处理姐；＠５与１０邋ｎＭ重组Ｉｒｉｓｉｎ蛋白共同处理组；⑨５帖／ｍｌ丝裂霉素Ｃ与蛋白共同处理组。分别在赔育１２和２４邋ｈ的时间点，用倒置相划痕区域的ＨＵＶＥＣ细胞进行拍照，并统计各组各时间点划痕面

【参考文献】

（一）重组Irisin蛋白诱导内皮细胞迁移和血管新生及其机制研究 （二）二氢杨梅素对顺铂引起肾损伤的保护性作用及其机制研

（一）重组Irisin蛋白诱导内皮细胞迁移和血管新生及其机制研究（二）二氢杨梅素对顺铂引起肾损伤的保护性作用及其机制研