粉尘螨Ⅲ类变应原的免疫治疗及其表位疫苗的探究

发布时间：2020-07-01 12:58

【摘要】：目的:探究粉尘螨Ш类变应原Der f 3的免疫治疗效果及其表位疫苗。方法:1.随机将40只BALB/c小鼠分为4组,PBS组(阴性对照组)、OVA组(阳性对照组)、Der f 3变应原致敏组(哮喘组)、Der f 3变应原免疫治疗组(SIT组)。哮喘组和SIT组小鼠用粉尘螨粗提液分别于0、7、14 d进行腹腔注射致敏,第21 d滴鼻激发,连续7 d,其中免疫治疗组小鼠在第25~27 d滴鼻激发之前30 min用Der f3蛋白皮下注射进行特异性免疫治疗。PBS组和OVA组分别用PBS和OVA进行腹腔注射和滴鼻激发。最后一次滴鼻激发24 h后脱臼处死。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行白细胞总数和嗜酸性粒细胞计数;ELISA检测BALF和脾细胞培养上清液(SSCS)中细胞因子IL-5、IFN-γ及血清中变应原特异性IgE、IgG2a抗体水平;肺组织进行HE染色。2.运用生物信息学分析软件预测Der f 3的T细胞抗原表位并人工合成所预测的T细胞表位肽;采用改良MTT法,用预测表位肽刺激致敏小鼠脾淋巴进行脾淋巴细胞增殖实验;酶联免疫吸附试验检测脾细胞培养上清液中细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-5水平。3.运用生物信息学在线预测Der f 3的B细胞线性抗原表位;人工合成所预测的B细胞表位肽并固定于硝酸纤维素膜上,将该膜分别与由12份螨性过敏哮喘患者血清组成的3个血清池孵育,再经抗人IgE-HRP二抗结合、DAB显色后,分析阳性点。4.构建包含表达含有Der f 3 T细胞表位和B细胞表位(在本实验室前期免疫试验中被证实所得的T细胞表位和B细胞表位)的载体基因并表达出该蛋白并命名为Der f 3-peptides,我们用该蛋白与特异性T细胞株(来自Der f 3皮肤点刺试验阳性患者的外周血单核细胞)共培养进行了T细胞增殖实验,测定上清中的细胞因子水平,并对比了Der f 3和Der f 3-peptides与特异性抗体Ig E结合的能力。结果:1.与哮喘组相比,SIT组小鼠肺部炎症明显减轻,BALF中白细胞总数和嗜酸性粒细胞数显著低于哮喘组(p0.01)。ELISA法检测各组小鼠SSCS及BALF中的IL-5和IFN-γ水平;结果表明SIT组的BALF和SSCS中IL-5的水平明显低于OVA组和哮喘组(p0.01),而IFN-γ含量则显著升高(p0.01);与OVA组和哮喘组相比,SIT组血清中的变应原特异性抗体Ig E浓度明显降低(p0.01),而IgG2a浓度则显著升高(p0.01)。2.成功预测了Der f 3中的5个T细胞表位肽,通过脾淋巴细胞增殖试验,其中3个表位肽序列可促进脾淋巴细胞增殖并刺激细胞因子IL?2和IFN?γ的分泌,抑制细胞因子IL?4和IL?5的分泌。其序列分别是37DCPYQISLQSSSHFCGG54、98IYQHENYDSMTIDNDVALIKLKTPMT123和164SELQRVDIDVVS REQCDQLYS184。3.成功预测了Der f 3中的8个B细胞表位肽,与过敏性血清中变应原特异性IgE结合试验获得5个强阳性表位肽序列。其对应的序列分别为33KAKAGDCP40、86HASGGEKIQVAEIYQHENYDSMTID110、118LKTPMTLDQTNAKPVPLPPQGSDVKVG144、156QEGSYSLP163及199DVANGGVDSCQGDSGGPVVD218。4.Der f 3-peptides可以引起特异性T细胞增殖,同时细胞因子IL-2/IFN-γ水平有上升趋势而细胞因子IL-4/5水平较低,结果表明Der f 3-peptides与Der f 3蛋白对特异性T细胞的刺激增殖能力相似甚至更强;Der f 3-peptides与Der f 3相比,其与抗体IgE的结合力明显降低。结论:粉尘螨Ш类变应原可有效地进行SIT,成功鉴定了Der f 3变应原中3个T细胞表位序列和5个B细胞表位序列并成功构建含有T、B细胞表位的小分子低毒过敏原,为诊断和治疗过敏性哮喘奠定一定基础。
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392

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