肠源益生性抑菌乳酸菌的分离筛选及其抑菌物质的研究

发布时间：2020-07-03 02:52

【摘要】：随着人们生活环境及饮食作息的改变,许多新型疾病开始出现并严重威胁着人类健康。在“大健康”理念及其产业化背景下,人们的健康意识逐渐提升,对比抗生素的使用所带来的种种问题,益生菌疗法受到广泛的关注。随着益生菌疗法在疾病应用中的不断深入研究,益生菌在新型及重大疾病防治领域的新功能不断刷新着人类的认知。我国人口众多,饮食文化差异显著,导致人体肠道菌群多样性及丰富度高,这为益生菌的研究提供了良好的样本来源。乳酸菌是其中代表性的益生菌,且作为人体肠道内的优势菌群,能够调节人体肠道菌群平衡、改善宿主健康,对预防疾病尤为重要。本研究旨在分离来源于中国健康人群肠道的乳酸菌,并从中筛选出具有抑菌活性的乳酸菌,通过模拟胃液、肠液试验及表面疏水性试验对菌株的益生性进行初步探究,通过抗生素纸片扩散法分析菌株的耐药性,并分析具有潜在益生性及安全的菌株其发酵液中主要抑菌物质,以期获得更适合我国人群肠道特点,具有高抑菌性及优良益生性,日后有望进行生产应用的潜力菌株。主要研究结果如下:从10份健康成年人的粪便中分离、纯化得到80株乳酸菌,根据16S rRNA基因相似性分析,确定它们分别属于乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)和链球菌属(Streptococcus)这5个属中的12个种。为节约人力物力,将应用潜力较低的肠球菌、格氏乳球菌及唾液链球菌,根据系统发育树进化亲缘关系挑选出11株代表菌株,分别为:菌株2(Lactococcus garvieae)、菌株11(Lactococcus garvieae)、菌株17(Enterococcus thailandicus)、菌株28(Enterococcus gallinarum)、菌株29(Streptococcus salivarius)、菌株30(Enterococcus faecium)、菌株32(Enterococcus gallinarum)、菌株33(Enterococcus hirae)、菌株59(Enterococcus durans)、菌株63(Enterococcus faecalis)、菌株78(Enterococcus faecium),与乳杆菌菌株1、6、8、20、60、65(Lactobacillus salivarius)、菌株9(Lactobacillus ghanensis)、菌株24(Lactobacillus paracasei),及明串珠菌属的菌株12(Leuconostoc lactis),共20株菌进行后续的抑菌筛选试验。以大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923为指示菌,通过牛津杯双层琼脂扩散法对20株乳酸菌进行抑菌性试验,筛选出5株对两种指示菌均有明显抑制效果的乳酸菌,依次为菌株1(Lactobacillus salivarius)、菌株9(Lactobacillus ghanensis)、菌株12(Leuconostoc lactis)、菌株24(Lactobacillus paracasei)及菌株63(Enterococcus faecalis)。对此5株具有抑菌活性的乳酸菌进行益生性及耐药性研究,筛选出的3株在pH3.0的模拟胃液中具有较强的生存能力,在含0.3%牛胆盐的模拟肠液中具有较高的存活率,具有一定的粘附性,无多重耐药性的乳酸菌,分别为菌株1、菌株12及菌株24。此3株乳酸菌所产的抑菌物质及性质研究表明,3株乳酸菌发酵液中抑菌物质热稳定性较好,且过氧化氢均不是它们发挥抑菌活性的主要有效成分。菌株12主要抑菌成分为有机酸;菌株1及菌株24的主要抑菌成分为有机酸及蛋白类物质。对于发酵液中可能存在的蛋白类抑菌物质,选择硫酸铵沉淀法、有机溶剂萃取法及双水相萃取法对其进行提取研究,并对提取条件进行优化,结果发现硫酸铵沉淀法的提取效果不理想,推测两株菌发酵液中存在的是小分子肽类。有机溶剂法及双水相法对样品均具有较好的提取效果,且双水相系统提取效果最佳,经双水相萃取后菌株1发酵液中粗提所得抑菌物质比活力为260.16,较原发酵液中提高了6.41倍,菌株24发酵液中粗提所得抑菌物质比活力为161.61,较原发酵液提高了4.35倍。两份粗提样品的电泳分析结果显示菌株1及菌株24的发酵液中的确存在细菌素,同时再一次证明了双水相系统对细菌素具有较好的提取效果。粗提物的抑菌谱试验结果表明两株菌所产的细菌素均具有较广泛的抑菌活性。综上,本研究共筛选到3株具有高抑菌活性的益生性乳酸菌菌株,为开发预防及治疗因肠道致病菌导致的肠道疾病的益生菌制剂提供菌种资源和应用基础。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R371
【图文】：

形态图,乳酸菌,镜检,形态

.1.2 分离乳酸菌株的染色及形态特征分离得到的 80 株乳酸菌，观察其菌落形态特征，菌落体积大小均有，形态凸起或扁平，边整齐或不整齐，颜色为乳白色、乳黄色或灰白色。对其进行革兰氏染色后镜检观察可得，分离得乳酸菌中既有杆菌也有球菌，排列方式为成对、短链或长链排列。具体形态学特征见表 3-1分乳酸菌镜检形态如图 3-1 所示。表 3-1 分离乳酸菌的形态特征Tab.3-1 Morphological characteristics of isolated lactic acid bacteria菌株数量菌落形态特征镜检形态6 乳白色，边缘整齐，小而凸起的菌落杆菌2 白色，边缘整齐，大而凸起的菌落杆菌30 乳白色，边缘整齐，小而凸起菌落球菌10 灰白色，边缘不整齐，大而扁平的菌落球菌7 乳黄色，边缘整齐，小而凸起菌的落球菌25 乳白色，边缘整齐，大而凸起菌落球菌

电泳图,乳酸菌,电泳图,系统发育树

DNA marker；1： lactobacillus salivarius；2：: Leuconostoc lactis；3：LactobLactobacillus paracasei；5： Enterococcus faecium；6：Lactococcus g图 3-2 部分乳酸菌 16S r DNA 扩增电泳图.3-2 Electrophoresis pattern derived from 16S r DNAamplification of lact增产物测定所得序列，通过 NCBI BLAST，同 GenBank 数据库中已知 6.0 软件进行序列分析，构建系统发育树进一步确定菌株种属。系统发育树的建立确定分离得到的 80 株菌株均为乳酸菌，分acillus）、乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、肠球属（Streptococcus）5 个属，共有 12 个种。其中乳酸杆菌 8 株，分为 6 个种；格氏乳球菌 27 株；乳酸明串珠菌 1 株；唾液链球菌 7 株。表 3-2，分离所得乳酸菌 16S rRNA 基因序列系统发育树如图 3-3 所示发育树，2）为乳杆菌属系统发育树，3）为肠球菌属系统发育树，，5）为乳球菌属系统发育树，乳球菌属中分离得到的乳球菌均为格部分菌株。得到的 80 株乳酸菌中，肠球菌在其中占较大比例。国外的一些研究在肠道中会在某些情况下转为条件致病菌，虽然我国对肠球菌作为益但世界卫生组织（WHO）建议减少肠球菌在益生菌制剂中的使用[70

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