结核分枝杆菌醇脱氢酶adhA通过调节代谢影响持留菌形成

发布时间：2020-07-03 08:32

【摘要】：抗生素耐药性是威胁人类健康安全的主要问题之一。大多数导致慢性感染并且难以治愈的致病菌本身并不具有抗生素耐药性。大量研究表明,具有药物耐受性的持留菌是造成病情反复和药物治疗能力下降的重要原因。持留菌是在抗生素致死剂量下仍可以存活的表型突变体,可以保持低代谢活性状态并在压力条件移除后恢复正常生长,但它们并不改变细菌群体对于药物的敏感性。持留现象最先在青霉素处理的金黄色葡萄球菌中被发现,随后,人们逐渐发现持留是存在于细菌群落中的普遍现象,持留菌造成细菌感染慢性疾病的治疗难题。持留菌对于抗生素产生的药物耐受是暂时性非遗传表型,多种难治愈慢性感染疾病均与细菌持留有关,包括结核病。结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病,结核菌可能侵入人体以肺脏为代表的全身各种器官。随着研究的深入,结核分枝杆菌的持留相关基因被相继发现,这些基因大多和细菌的新陈代谢和表达调控有关。酮、醛和醇是原核生物和真核生物所必需的物质,催化它们相互转化的酶可主要分为三大类:NAD(P)依赖性醇脱氢酶(ADH),非NAD(P)依赖性醇脱氢酶和催化醇的不可逆氧化反应的FAD依赖性醇氧化酶。微生物的ADHs可以进一步分为三个主要的亚类,它们的广谱底物包括脂肪醇、芳香醇、酮和醛。在ADH催化醇转化为醛的过程中,NAD~+会被还原为NADH。目前,关于细菌ADHs的研究主要集中在代谢,乙醇耐受,亚硝化应激和毒力等方面,尚未有报道在结核分枝杆菌持留形成中的作用。通过结核分枝杆菌基因数据库,结核分枝杆菌基因组中编码了二十种假定的醇脱氢酶。通过查阅文献资料,我们发现结核分枝杆菌醇脱氢酶基因adhA在细菌非复制阶段、低酸压力和饥饿状态下的转录水平有着明显的改变,并且有报道称它与结核分枝杆菌生物膜形成有关。因此我们猜想adhA很可能参与了分枝杆菌持留菌的形成。我们利用结核分枝杆菌的模式菌株耻垢分枝杆菌M.smegmatis对醇脱氢酶adhA在持留菌形成中的作用进行了初步研究。我们在耻垢分枝杆菌中敲除了结核分枝杆菌adhA的同源基因MSMEG_3615,发现在高浓度抗生素处理下,adhA缺失的耻垢分枝杆菌突变菌的存活率明显降低且并不改变细菌群落的抗生素药物敏感性,这表明adhA基因对耻垢分枝杆菌持留菌的形成有重要作用。为研究这一现象的机制和醇脱氢酶的具体功能,我们首先进行体外实验,发现ΔadhA突变体的形态发生了明显变化,单菌落褶皱增多且更加干燥,尼罗红染色荧光量上升;细菌长度变短,疏水指数和膜电位降低;在SDS,联氨,双氧水压力下存活率下降;胞内ATP含量上升,NADH含量下降而NAD~+含量不变,造成NAD~+/NADH比率上升;通过RT-PCR实验,发现adhA缺失后,其他持留相关基因的转录水平有明显升高。通过细胞实验,发现在THP-1分化的巨噬细胞中,ΔadhA突变体的胞内存活率明显降低,且改变了宿主细胞因子的产生,但并未观察到宿主细胞坏死和凋亡的变化。综上所述,我们发现醇脱氢酶基因adhA可以增加耻垢分枝杆菌持留菌的形成,这一作用可能是通过改变细菌细胞壁形态和调节细菌能量代谢达到的。这是第一次发现醇脱氢酶在细菌持留中的重要作用,可以对分枝杆菌持留菌形成提供参考。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R378.911
【图文】：

耐药,抗生素,主旨,结核分枝杆菌

-1 耐药、耐受和持留细菌的抗生素杀菌曲线。 1-1 Antibiotic killing kinetics of resistant, tolerant and persister cells.结核分枝杆菌是结核病的致病菌。2014 年，世界卫生大会批准了结核病战略”，该战略的主旨是终结全球结核病流行，其目标是

耻垢分枝杆菌,双氧水,存活率,醇脱氢酶

8mM 双氧水处理后耻垢分枝杆菌的存活率。 **P < 0.01, ***P < 0.001。 Survival rate of M. smegmatis upon exposure to 8mM H2O2. **P < 0.01, *** 敲除醇脱氢酶基因 adhA 降低耻垢分枝杆菌在 SDS 胁迫下的存DS 是一种常用的表面活性剂，可以用来检测细菌细胞壁保护酶 adhA 在酮、醇和醛之间的转化中具有重要作用，这些物合成的基本原料。因此，我们用 SDS 来检测醇脱氢酶 adhA保护特性。我们分别用 0.1%、0.2%和 0.3%的 SDS（m/v）处，并通过滴板实验获得 CFU 计算存活率，结果如图 4-3。根脱氢酶基因 adhA 后，耻垢分枝杆菌在 SDS 胁迫下存活能力性减弱。所以，醇脱氢酶 adhA 可以影响细胞壁的稳定性。可能与细胞壁的合成有关。

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