YTHDF3负向调控I型干扰素抗病毒天然免疫应答及其机制研究

发布时间：2020-07-06 08:35

【摘要】：抗病毒天然免疫系统是生物长久进化选择的结果,是抵抗病毒感染的第一道防线。I型干扰素(Type Ⅰ interferons,IFN-I)是脊椎动物对抗急性病毒感染的重要效应分子,分为IFN-α和IFN-β两大类。IFN-I通过JAK-STAT信号通路激活上千个干扰素诱导基因(IFN-stimualted genes,ISGs)的转录。宿主产生的ISGs可以通过抑制病毒穿入、扰乱病毒复制以及降解病毒蛋白和核酸等方式来限制病毒生命周期,从而抵抗单股正链RNA((+)ssRNA)病毒、单股负链RNA((-)ssRNA)病毒、双链RNA(dsRNA)病毒和DNA病毒的感染。干扰素应答的失调可能导致抗病毒免疫功能缺陷或自身免疫性疾病。因此,IFN-I应答要受到紧密调控,其动态平衡对于机体内环境稳定与抵御外部病原体入侵尤为重要。IFN-I信号通路能通过自分泌环(Autocrine loop)维持自我稳态,而且IFN-I信号通路组成分子IFNAR、JAK1、TYK2、STAT1、STAT2和IRF9广泛性地表达在多种细胞中。由于STAT1和IRF9在天然免疫细胞中的组成性本底表达比较高,天然免疫细胞对低剂量的IFN-I就能够快速做出应答。抗病毒免疫的效应分子和调控因子受到转录水平、翻译水平以及翻译后水平的调控。机体通过翻译水平调控某些特定基因的表达来迅速适应外界环境应激,这样的调控模式也是宿主抗病毒天然免疫应答调控的理想型模式。宿主通过操控自身的翻译机器来产生更多的抗病毒效应分子。因此,通过选择性翻译调控蛋白表达对于防御病毒感染也是至关重要的。但是,目前对于抗病毒天然免疫在翻译水平调控的研究报道不多,需要更深入地研究。近年来,随着众多表观酶和表观修饰方式的发现和研究,免疫系统分化发育与功能的表观调控成为生物医学的一个前沿热点课题。目前对于天然免疫应答的表观调控的研究尚刚刚起步,有许多未知领域值得探索。在本课题研究中,我们发现m6A的读码器YTHDF3通过促进转录抑制因子FOX03蛋白表达,从而负向调控I型干扰素介导的抗病毒天然免疫应答。为了研究YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3是否参与抗病毒天然免疫应答,我们通过siRNA干扰和CRISPR-Cas9敲除巨噬细胞中YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的表达,我们发现只有干扰YTHDF3和敲除YTHDF3会显著抑制VSV复制。与此同时,我们发现YTHDF3缺失可以抑制EMCV和HSV-1复制,表明YTHDF3具有广谱的抗病毒作用,而且病毒感染能抑制YTHDF3的表达,表明YTHDF3可能是一个重要的抗病毒天然免疫反馈调节分子。YTHDF3缺失后,本底ISGs选择性地表达升高;但是当I型干扰素受体IFNAR1缺失后,我们发现干扰YTHDF3和双敲YTHDF3-/-Ifnar1-/-与对照组相比,ISGs的表达和抗病毒能力均没有差异,表明YTHDF3负向调控抗病毒天然免疫依赖于IFNAR1。体内实验表明,YTHDF3-/-小鼠相对于同窝对照野生型小鼠更能抵抗VSV感染。为了研究YTHDF3负向调控抗病毒天然免疫的分子机制,我们通过增强型紫外交联免疫沉淀联合高通量测序(eCLIP-seq)实验,找到YTHDF3的靶向RNAs。通过生物信息分析,我们发现YTHDF3能够结合FOX03(Forkhead boxprotein 03)mRNA的翻译起始区域。FOX03是转录抑制分子,能够特异地负向调控抗病毒效应分子的本底表达。YTHDF3缺失能降低FOX03蛋白表达,而且只有全长的YTHDF3蛋白才能结合FOX03 mRNA 和其他靶向 RNAs。YTH(YT521-B homology)结构域、缺失 YTH 结构域的突变体或缺失脯氨酸/甘氨酸/天冬氨酸富集结构域的突变体对于FOX03 mRNA的结合能力都显著下降,而且结合RNA骨架的K422和R533以及形成的疏水口袋特异识别m6A的W438和W492突变成丙氨酸后,同样失去了结合靶向FOX03的能力。为了研究YTHDF3的分子功能,我们通过质谱鉴定了 YTHDF3相互作用蛋白组,发现YTHDF3结合蛋白翻译起始因子和多种RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)。通过分析YTHDF3的相互作用蛋白组,我们推测YTHDF3在翻译水平调控了 IFN-I介导的抗病毒免疫应答,并且我们发现PABP1和eIF4G2能够与YTHDF3协同调控FOX03的翻译。最后,通过在YTHDF3缺失细胞中回补FOX03的表达,发现其可以逆转缺失YTHDF3抑制病毒复制的作用,从而证明YTHDF3与PABP1和eIF4G2协同促进FOXO3的蛋白翻译,从而负向调控Ⅰ型干扰素介导的抗病毒天然免疫应答。我们的研究证实YTHDF3通过促进FOXO3蛋白表达来负向调控I型干扰素抗病毒天然免疫应答。我们提出了一个抗病毒天然免疫应答翻译调控的新模式。YTHDF3不仅可以成为用于增强ISGs本底表达来抵抗病毒感染的一个潜在靶点,还可能参与肿瘤和自身免疫性疾病的发生发展,也可能会作为肿瘤和自身免疫性疾病防治的潜在靶点。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

图２．３邋ＹＴＨＤＦ３促进ＶＳＶ复制逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．３邋ＹＴＨＤＦ３邋ｐｒｏｍｏｔｅｓ邋ＶＳＶ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑

病毒复制,广谱,病毒,缺失

用ＥＭＣＶ邋（单股正链ＲＮＡ病毒，（（＋）ｓｓＲＮＡ））和ＨＳＶ－１邋（ＤＮＡ病毒）感染１２ｈ，Ｑ－逡逑ＰＣＲ检测ＥＭＣＶ的ＲＮＡ和ＨＳＶ－１的ｇＤＮＡ，我们发现干扰ＹＴＨＤＦ３后的腹腔巨噬细胞逡逑能够抑制ＥＭＣＶ和ＨＳＶ－１的复制（图２．４Ａ）。我们又在ＹＴＨＤＦ３缺失的ＲＡＷ２６４．７细逡逑胞中，同样感染ＥＭＣＶ和ＨＳＶ－１，结果和干扰ＹＴＨＤＦ３—致（图２．４Ｂ），都能够有效逡逑地抑制病毒的复制。根据上述结果，我们可以得出ＹＴＨＤＦ３缺失的细胞能够有效抵逡逑抗ＲＮ邋Ａ病毒和ＤＮＡ病毒的感染，证实ＹＴＨＤＦ３具有广谱的促进病毒复制能力。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑□邋ｓｉＣｔｒｌ逦□邋ＹＴＨＤＦ３ｔ，＋逦□邋ｓｉＣｔｒｌ逦□邋ＹＴＨＤＦ３＋／４逡逑■邋ｓｉＹＴＨＤＦ３逦■邋ＹＴＨＤＦ３＇－逦？逦■邋ｓｉＹＴＨＤＦ３逦￣逦■邋ＹＴＨＤＦ３—＇—逡逑孓邋１０逦＾逦＃rP保埃埃?逦共＂0邋１５邋■逦４0１逦

免疫细胞,脾肿大,细胞,脾脏

结果表明小鼠脾脏中的ＣＤ１９＋Ｂ细胞、ＣＤ４＿Ｔ细胞、ＣＤｒＴ细胞、ＮＫ细胞、逡逑树突状细胞和巨噬细胞的组成百分比没有改变（图２．１０）。但有趣的是，ＹＴＨＤＦ３＋逡逑小鼠脾脏相对于野生型小鼠表现明显肥大（图２．１１邋），出现脾肿大症状（Ｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙ邋）。逡逑我们推测其原因可能脾脏中某类细胞数量增多，另外ＹＴＨＤＦ３＋基因缺失引起的逡逑ＩＳＧｓ表达升高，包括一些炎症性基因的高表达，也可能引起脾脏进行性慢性炎症，逡逑使得小鼠脾脏变大。对于脾肿大这一现象，我们需要进一步深入研究。逡逑ＡＢＣ逡逑Ｂ邋ｃｅｌｌｓ逦ＣＤ４＋邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ逦ＣＤ８＋邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑１１逦１＊１，，＜：逦２８５％逦２＾９％逦＂邋＊［；逦＾｜－１逦１３．８％逡逑４＾５％逦１邋ｊ］逡逑＾逦？？鳙，逦ｗ邋”ａ邋？，逦？．邋＊？邋？，邋ｗ＊邋＊，》？逦？？邋？

【二级参考文献】