FGF-10对高氧诱导新生小鼠BPD模型肺损伤的修复作用研究

发布时间：2020-07-07 03:36

【摘要】：支气管肺发育不良(BPD)是婴儿最常见的慢性肺疾病(CLD)之一,经典型BPD首先作为因氧气和机械通气导致的肺损伤由Northway团队于1967年描述并定义的。尽管近几十年来主要治疗措施取得进展,BPD发病率仍较高。然而预防和治疗BPD的方式仍非常有限,药物治疗主要是减轻症状,而效果不理想,因此重新启动肺泡生长和诱导肺泡结构发育的治疗策略将成为治疗目标。FGF-10是一种旁分泌细胞因子,主要表达于间充质细胞,调节间质-上皮相互作用信号,它参与多种组织器官的发育和损伤修复过程,并具有重要作用,尤其在肺发育和损伤修复过程中作用显著。本项研究首先建立高氧诱导的新生小鼠BPD模型,之后对BPD模型小鼠肺中FGF-10的表达进行检测,再将BPD模型小鼠肺细胞进行体外培养,进一步检测FGF-10是否对细胞炎性因子、间充质干细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞有影响。初步探讨FGF-10与NF-κB相互作用关系。构建pCDHFGF10载体,并检测其表达,为下一步研究FGF-10预防和治疗BPD提供实验依据。本研究分为以下五部分:研究内容一:将80只2日龄昆明小鼠平均随机分配到箱内氧浓度维持60%-70%的高氧组和空气组。高氧组小鼠置于底部铺有钠石灰以吸附CO_2的自制密闭养殖箱,维持CO_2浓度0.5%。两组均乳母鼠共处以哺乳新生小鼠,将两组母鼠每日交换以防母鼠高氧不耐受而死亡。建立新生小鼠BPD模型。生后21天时,高氧组小鼠体型偏小,体重增长不理想;毛发不光顺,离氧后精神烦躁,出现呼吸困难及口唇、趾端紫绀表现。高氧组小鼠肺HE染色可见其结构逐渐出现BPD样表现,早期可见肺泡间隔增厚、出血及炎性细胞浸润,后期可见肺泡数量减少、肺泡融合形成及炎性不张,证明高氧诱导的新生小鼠BPD模型建立成功。研究内容二:为研究FGF-10在BPD中的作用,我们首先检测了FGF-10在新生小鼠BPD模型中的表达情况。我们使用免疫组化法分别检测4天、7天、14天、21天的高氧组和空气组小鼠鼠肺,结果显示,生后21天时,高氧组小鼠鼠肺中FGF-10表达明显减少。进而,我们将相应日龄的两组小鼠鼠肺进行RT-PCR和Western Blot检测。生后21天时高氧组小鼠FGF-10 mRNA水平明显减少。Western Blot结果显示,高氧组小鼠FGF-10表达随着日龄增加而逐渐减少。这表明高氧诱导的BPD模型小鼠肺FGF-10 mRNA水平和蛋白水平减低。研究内容三:为检测外源性补充FGF-10因子是否对BPD有改善作用,我们将空气组与高氧组小鼠鼠肺分为normoxia、normoxia+FGF-10、hyperoxia、hyperoxia+FGF-10四组进行体外培养。进而使用ELISA法检测各组上清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-2、TGF-β等6个炎性细胞因子的表达,检测发现hyperoxia组,IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-2、TGF-β均明显升高,而加入FGF-10可逆转IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-2、TNF-α的升高,提示FGF-10可减轻体外培养肺细胞炎症反应。为检测FGF-10能否对外培养肺间充质干细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞具有促进生长的作用,我们利用流式细胞术检测CD29~+CD90~+双阳性与CD34~-CD105~+单阳性的细胞表面分子标志物,结果显示,hyperoxia组CD29~+CD90~+双阳性细胞比例最低,hyperoxia+FGF-10组双阳性细胞比例明显升高;肺泡Ⅱ型上皮细胞生长的作用,通过免疫荧光检测,发现hyperoxia组SPC表达减少,hyperoxia+FGF-10组SP-C表达明显增高,证明FGF-10具有促进肺间充质干细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞生长的作用,说明FGF-10可通过此过程修复肺损伤。研究内容四:研究报道NF-κB抑制FGF-10表达,而我们研究发现FGF-10可减低炎性因子表达,因此我们设想FGF-10是否反馈抑制NF-κB表达。高氧组小鼠鼠肺NF-κB p65的表达通过免疫组化来检测,加入FGF-10对体外培养小鼠肺细胞NF-κB p65的表达情况通过Western Blot来检测。结果表明,高氧组小鼠鼠肺14天、21天NF-κB p65表达显著增高,加入FGF-10可明显减低体外培养小鼠肺细胞NF-κB p65的表达。提示FGF-10可反馈抑制NF-κB p65表达,这为FGF-10减轻肺损伤炎症反应提供了理论支持。研究内容五:为进一步探寻FGF-10在肺损伤修复中的作用和其中可能的机制,我们构建了pCDH-FGF10重组表达载体,使用菌液作为PCR模板进行扩增,鉴定FGF-10表达,结果可见特异条带出现在大约600bp处,与fgf10的碱基数吻合。挑取阳性克隆进行基因测序,结测序结果与fgf10序列完全匹配,证明构建pCDHFGF10重组表达载体成功。Western Blot检测经转染的细胞,结果显示可体外表达。这为下一步实验奠定了实验基础。总之,本研究证实了我们的实验设想,外源性补充FGF-10可对新生小鼠BPD模型的肺损伤起到修复作用,并对其可能的机制进行了初步探讨,这为探寻BPD新的并且有效的临床治疗手段提供了思路。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R722.6;R-332
【图文】：

海军军医大学博士学位论文三、结果（一）小鼠一般情况在模型建立过程中，高氧组小鼠未出现高氧不耐受而死亡情况，空气组小鼠亦无死亡。生后 7 天时，高氧组小鼠精神反应、活动、进食、呼吸等情况与空气组无明显差异。至生后 14 天时，高氧组小鼠活动减少，反应状况变差，离氧一段时间后精神烦躁。毛发粗糙、蓬乱、光泽差。生后 21 天时，高氧组小鼠体重增长欠佳，体型偏小，毛发不光顺，一旦离氧便有烦躁、呼吸急促、口唇及趾端发紫等缺氧表现。而空气组小鼠体重增长佳，毛发光泽、反应情况均良好。两组小鼠入组时体重无差异，但至生后 21 天时，两组小鼠体重 (n=22)分别为 16.7±1.44g 和 22.2±1.81g，差异有统计学意义(t=-11.187，P<0.001)（图 1）。

21天的鼠肺，通过Image-Pro Plus 6.0软件分析平均光密度，结果显示，两组小鼠鼠肺中FGF-10表达在4天、7天、14天无明显差异。而21天时，高氧组小鼠鼠肺中FGF-10表达较空气组小鼠明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）（图1）。进而，我们采用实时定量PCR和Western Blot方法检测相应日龄的两组小鼠鼠肺FGF-10 mRNA及FGF-10表达情况。实时定量PCR检测结果显示FGF-10 mRNA水平，两组小鼠4天、7天、14天无明显差异，而21天时高氧组小鼠较空气组明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western Blot检测发现，随着日龄增加，高氧组小鼠FGF-10表达逐渐减少，而空气组小鼠FGF-10表达无明显变化（图2）。

天、14天无明显差异，而21天时高氧组小鼠较空气组明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western Blot检测发现，随着日龄增加，高氧组小鼠FGF-10表达逐渐减少，而空气组小鼠FGF-10表达无明显变化（图2）。

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本文编号：2744590