VZV糖蛋白E基因胞外域的克

发布时间：2020-07-12 15:27

【摘要】：目的:分别用原核和真核细胞稳定表达水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(glycoprotein E,g E)的基因胞外域,对融合蛋白进行特异性鉴定和免疫反应性分析,将这两种融合蛋白分别免疫新西兰家兔,制备兔抗VZV g E多克隆抗体;应用融合蛋白作为抗原建立检测VZV特异性抗体的血清学试验,开展对VZV感染的流行病学调查,以评价VZV疫苗的免疫效果,为易感人群VZV感染的诊断和治疗以及水痘预防措施的制定提供重要的实验依据,并为研制安全性更高的VZV g E亚单位疫苗奠定基础。方法:从临床采集带状疱疹患者的皮肤囊泡液接种至单层人胚胎成纤维细胞(human embryo fibroblast,HF),进行病毒分离;对分离的病毒株进行特征性细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),间接免疫荧光和DNA测序鉴定。将确认的VZV临床分离株体外培养,PCR扩增VZV g E基因胞外域片段,分别构建原核表达质粒g E-p ET-32a(+)和真核表达质粒g E-p CDNA3.1/myc-His(-),测序后将原核质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,获得VZV g E原核表达的融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳、Western blot鉴定融合蛋白的特异性,利用Ni2+-NTA柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。将真核质粒用脂质体介导转染至COS-7细胞,经G418筛选出稳定表达VZV g E蛋白的细胞株,表达产物经Ni2+-NTA柱纯化;通过RT-PCR检测VZV g E基因的m RNA,Western blot和间接免疫荧光检测g E融合蛋白的免疫反应性。分别用纯化后的原核表达g E蛋白和真核表达g E蛋白免疫新西兰家兔,获得兔抗VZV g E多克隆抗体。ELISA法分别测定该抗体及其效价。应用真核细胞表达的g E重组抗原包被ELISA酶标板,建立VZV抗体检测的血清学试验。对127份0~10岁正常儿童血清中VZV Ig G抗体水平进行检测,以评价VZV疫苗的免疫效果。结果:利用原核表达,成功诱导表达出VZV g E融合蛋白,SDS-PAGE鉴定表明其为包涵体表达,表达量约为3.01 mg/ml,Ni2+-NTA柱纯化后,g E蛋白纯度约为90%。Western blot显示,经变性、复性后的该融合蛋白具有良好的免疫反应性。免疫新西兰家兔后获得兔抗VZV g E多克隆抗体,ELISA测定显示,多克隆抗体效价为1:6400~1:12800;利用真核表达,成功筛选出能够稳定表达VZV g E基因胞外域的COS-7细胞株,RT-PCR检测到相应的m RNA,间接免疫荧光和Western blot鉴定,该g E融合蛋白具有较强的免疫反应性;COS-7细胞株和其培养液中均有g E融合蛋白,表达量约为0.632 mg/ml,Ni2+-NTA柱纯化后,g E蛋白纯度约为90%。免疫新西兰家兔后获得兔抗VZV g E多克隆抗体,ELISA测定显示,多克隆抗体效价为1:25600~1:51200。应用真核g E抗原包被ELISA板,检测了127份0~10岁儿童血清中VZV Ig G抗体,总阳性率为81.89%,特异度和灵敏度分别为93.75%和88.24%。结论:本实验成功构建了稳定高效表达VZV g E蛋白的原核表达和真核表达系统,获得较高纯度的g E蛋白,有利于全面研究此蛋白的生物学功能,并为VZV亚单位疫苗的制备奠定基础。制备了特异性及效价较高的兔抗VZV g E多克隆抗体,建立了快速诊断VZV感染的ELISA血清学试验,有助于VZV疫苗免疫效果的监测和VZV感染的流行病学调查,为水痘预防措施的制定提供了重要的实验依据。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【图文】：

细胞,皮肤,患者

患者皮肤囊泡液接种至 HF 细胞后出现 CPE 结果(×200).A：正常 HF 细胞；B：V 细胞（5~7 天）ZV cytopathic effects in HF cells (×200). A: Normal HF cells monolayer; B: VZV incells (5~7 days).

序列,原核,重组质粒,产物

安徽医科大学硕士学位论文原核重组质粒 gE-pET-32a(+)和真核重组质粒 gE-pCDNA3.1/myc-His(-鉴定PCR 扩增的 gE 基因的产物和重组质粒 gE-pET-32a(+)被双酶切后的产物凝胶电泳，均可见 1617 bp 的目的条带。图 3、4。该产物经 DNA 测序后T 法与 GenBank 数据库比对，其序列与 VZV Dumas 标准株基因组 DNA 的应序列符合率为 100%。图 5。

重组质粒,真核,酶切鉴定,PCR扩增

重组质粒 gE-pCDNA3.1/myc-His(-)的构建与酶切鉴定. A：gE 基因胞外域重组质粒单、双酶切鉴定。 M：Marker；1: 目的基因片段；2: 以 ddH2O照；3: 重组质粒；4: 重组质粒经 Xhol I 酶切；5: 重组质粒经 HandIII 酶双酶切。e construction of the gE-pCDNA3.1/myc-His(-) plasmid. A: PCR amplificalar domain; B: Identification of recombinant plasmid with restriction enzymerker; 1:gE extracellular domain gene product; 2: PCR negative cA3.1/myc-His(-) plasmid; 4: Xhol I enzyme digestion; 5: HandIII enzymeand HandIII double enzyme digestion.

【参考文献】