呼吸道合胞病毒新型表位的鉴定及免疫效果评估

发布时间：2020-07-12 19:21

【摘要】：第一部分呼吸道合胞病毒预防性肽疫苗的设计目的:尝试运用理论设计和分子模拟技术确定和优化呼吸道合胞病毒的肽疫苗。方法:首先检索蛋白质晶体结构数据库中呼吸道合胞病毒相关蛋白晶体结构数据和呼吸道合胞病毒中和抗体-识别肽段的复合物晶体结构数据。后采用分子模拟,分析了中和抗体与表位肽间作用方式;通过分子动力学模拟技术评估FFL-001抗原蛋白的各个部分对其稳定结构的作用及与中和抗体结合的影响;通过理性设计优化得到抗原肽,并评估其与中和抗体的作用,最终通过实验来验证其效果。结果:1.成功从蛋白质晶体结构数据库中获取RSV F蛋白变构前后高级结构晶体数据,抗体Motavizumab与其表位肽的共晶结构数据。2.对F蛋白变构前后的高级结构分析可知,F蛋白的结构中存在高级结构相对稳定的肽段,该肽段受F蛋白变构影响较小。该肽段亦是已开发的RSV中和抗体的靶标。3.结构和能量分析Motavizumab-FFL_001作用表明,FFL-001与抗体Motavizumab的结合区仅局限于H2和H3螺旋连接转角区(氨基酸65-89),在此相互作用界面上,存在9个氢键和一条盐桥作用。4.分子动力学结果表明,完整FFL-001能在整个动力学模拟时段内能维持稳定的空间结构,而缺少H1螺旋束的FFL_001的结构出现明显变构;H2和H3螺旋连接转角区(即Motavizumab结合位点肽段(氨基酸65-89))肽段结构只有其N端的一小段螺旋结构维持着,而其C-端和中间的氨基酸序列呈完全的无序状态。5.能量评估显示,全长的FFL-001产生的结合能ΔGtotal为-23.6kcal/mol;其中可分解为FFL-001与Motavizumab有益作用能ΔGint=-110.8kcal/mol,和不益的去溶剂化作用ΔGslv=71.5kcal/mol以及一部分较弱的熵惩罚作用-TΔS=15.7kcal/mol;双螺旋束H2-H3和Motavizumab结合位点肽段与完整的FFL-001相比呈现出完全不同能量变化;在与Motavizumab结合时,这两个肽段出现了较大的熵惩罚(-TΔS分别为47.2和27kcal/mol)和不利的去溶剂化作用(ΔGslv分别为52.6和58.8kcal/mol)。双螺旋束H2-H3的ΔGtotal为3.4kcal/mol,Motavizumab结合位点肽段的ΔGtotal为 7.9kcal/mol。6.对Motavizumab结合位点肽段进行截断和环化处理,能量评估显示不同的环化位点对于环肽与Motavizumab的结合产生较大影响;其中与Motavizumab结合表现最好的环化肽,命名为环化PV2;它与Motavizumab的亲和能ΔGtotal值达-21.2kcal/mol。实验结果亦显示,经人工合成环肽PV2与Motavizumab亦具有较强的亲和力(Kd为16.2n M)。结论:1.FFL-001中与Motavizumab直接作用的肽段(氨基酸65-89)与F蛋白中空间结构相对稳定的肽段的序列相一致。2.不同长度截断得到的含与Motavizumab直接作用部位的肽段经环化后的环肽与抗体Motavizumab亲和力存在明显的差异。环肽PV2与Motavizumab亲和力最好,与FFL-001相当。3.实验验证环化PV2确实能与抗体Motavizumab产生较强的作用。第二部分呼吸道合胞病毒F蛋白基因克隆及原核表达目的:得到全长RSV F蛋白,用于免疫小鼠和后续免疫效果评估。方法:首先通过培养宿主细胞扩增RSV病毒,提取病毒的基因后,通过反转录PCR及PCR技术克隆RSV F蛋白的基因,后将克隆到RSV的F蛋白基因克隆至原核表达质粒p ET-28a多克隆位点中;得到重组质粒p ET-28a-F导入大肠杆菌BL21中,并通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导进行原核表达。最后通过Ni2+亲和层析纯化重组的F蛋白。结果:1.病毒基因组经反转录后得到的c DNA为模板,经PCR扩增,成功克隆得到RSV的F蛋白基因。琼酯糖凝胶电泳检测结果显示,其序列总长约为1700bp,与预期相一致。后经测序鉴定序列正确。2.在一定浓度IPTG的诱导下,重组大肠杆菌成功地表达目的蛋白,经SDS-PAGE检测,目的蛋白大小约为70k D左右,与理论值相符。3.重组F蛋白经大肠杆菌大量表达后,经Ni2+亲和层析纯化后,得到纯度非常高的重组F蛋白。结论:1.通过分子克隆技术成功克隆得到RSV病毒的F蛋白基因。并能够成功地在原核生物中进行表达。2.经纯化得到重组F蛋白纯度较高,可用于后续实验。第三部分环化PV2与线性PV2蛋白免疫效果的研究目的:检测环化新型RSV抗原表位PV2在小鼠中的肌肉注射免疫效果和鼻黏膜免疫效果,并与非环化新型RSV抗原表位PV2的免疫效果进行比较。方法:1.培养并纯化足够量的RSV病毒,并测定得到的RSV的半数细胞培养物感染量(50%tissue culture infective dose,TCID50)。2.选取45只6~8周龄的雌性Balb/c小鼠,将其随机分为9组(5只/组):磷酸盐缓冲液(PBS)组;弗氏佐剂组;明胶佐剂组;PV2/明胶/滴鼻组;PV2/弗氏佐剂组/肌肉注射;环化PV2/明胶/滴鼻组;环化PV2/弗氏佐剂组/肌肉注射;F蛋白/明胶/滴鼻组;F蛋白/弗氏佐剂组/肌肉注射。3.首次免疫后2周进行第二次加强免疫,二次免疫后2周进行第三次加强免疫。首次和第二次免疫后第14天断尾取血,最后一次免疫后第10天,眼眶采血并处死小鼠。4.使用间接ELISA法检测肌肉注射和鼻免疫小鼠血清特异性Ig G抗体效价。5.采集小鼠肺、鼻灌洗液,使用间接ELISA法检测免疫小鼠肺、鼻灌洗液的特异性Ig G滴度。6.在Vero细胞模型中检测免疫小鼠血清中和抗体能力,采用微量中和试验检测免疫小鼠血清中和抗体滴度。同时通过间接免疫荧光检测小鼠抗血清对于病毒天然F蛋白的识别作用。结果:1.我们使用Vero细胞培养RSV病毒,培养7天后收获病毒上清,使用Karber法测定病毒的TCID50,结果显示病毒效价为10-8.5。2.间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性Ig G抗体效价结果显示:1)肌注的免疫效果优于滴鼻。其中,PV2/明胶佐剂/滴鼻组免疫三次后小鼠血清特异性Ig G抗体效价为1:40,PV2/弗氏佐剂/肌肉注射免疫三次后小鼠血清特异性Ig G抗体效价为1:158;环化PV2/明胶佐剂/滴鼻组免疫三次后小鼠血清特异性Ig G抗体效价为1:630,环化PV2/弗氏佐剂/肌肉注射免疫三次后小鼠血清特异性Ig G抗体效价为1:1584;F蛋白/明胶佐剂/滴鼻组免疫三次后小鼠血清特异性Ig G抗体效价为1:19952,F蛋白/弗氏佐剂/肌肉注射组免疫三次后小鼠血清特异性Ig G抗体效价为1:50118。2)环化的PV2诱导小鼠产生特异性Ig G抗体的能力明显优于非环化PV2。其中,PV2肽组:一免后没有特异性Ig G产生。二免后,有低水平的特异性Ig G抗体产生。在第三次免疫后,有一定水平的特异性Ig G抗体产生。环化PV2肽组:首次免疫后即可检测到特异性Ig G抗体,且每次免疫后的抗体的滴度都远高于PV2肽组,其初次免疫后的血清效价滴度甚至优于全长F蛋白的免疫效果。3.间接ELISA法测免疫小鼠肺灌洗液、鼻灌洗液特异性Ig G抗体效价结果显示:1)三种抗原蛋白通过肌注免疫使得小鼠肺中产生不同水平的特异性Ig G抗体,而在小鼠的鼻腔中,抗原环化PV2和F蛋白能诱导产生一定水平的抗体。而通过滴鼻免疫方式免疫的小鼠肺灌洗液、鼻灌洗液中均未检测到特异性Ig G抗体产生。2)PV2/弗氏佐剂/肌肉注射组肺灌洗液中特异性Ig G抗体效价为1:12。环化PV2/弗氏佐剂/肌肉注射组肺灌洗液中特异性Ig G抗体效价为1:132;鼻灌洗液中特异性Ig G抗体效为1:5。重组F蛋白肌肉注射免疫小鼠中,肺灌洗液中的抗体效价达1:891;鼻灌洗液中特异性Ig G抗体效为1:8。4.采用微量中和试验检测免疫小鼠血清中和抗体滴度结果显示:1)PV2/明胶佐剂/滴鼻组的小鼠血清中和抗体滴度达1:15;PV2/弗氏佐剂/肌肉注射小鼠血清中和抗体滴度达1:39。环化PV2/明胶佐剂/滴鼻组小鼠血清中和抗体滴度达1:63;环化PV2/弗氏佐剂/肌肉注射组小鼠血清中和抗体滴度达1:158。F蛋白/明胶佐剂/滴鼻组小鼠血清中和抗体滴度达1:39;F蛋白/弗氏佐剂/肌肉注射组小鼠血清达1:1584。2)所有滴鼻免疫组的小鼠血清中和抗体滴度明显低于肌注免疫组小鼠(P0.05)。5.通过间接免疫荧光测定中和抗体保护效果,结果显示非环化的PV2/明胶佐剂/滴鼻组无荧光显示,而PV2/弗氏佐剂/肌肉注射组有一定荧光强度但弱于天然F蛋白免疫组。环化的PV2肽免疫组荧光强度远强于阴性对照,其中环化PV2/弗氏佐剂/肌肉注射组荧光强度几乎与Motabizumab单抗效果相当。结论:1.三种抗原蛋白无论肌注还是滴鼻免疫,都在小鼠体内诱导产生血清特异性Ig G抗体。环化PV2诱导小鼠产生血清特异性Ig G抗体的能力明显优于非环化的PV2,但弱于全长F蛋白。2.三种抗原蛋白通过肌注免疫均能诱导小鼠肺中产生特异性Ig G抗体,但仅有环化PV2和F蛋白能诱导鼻腔产生特异性Ig G抗体。环化PV2诱导小鼠的肺灌洗液中特异性Ig G抗体效价明显优于非环化的PV2,但弱于全长F蛋白。3.三种抗原蛋白通过滴鼻免疫方式免疫的小鼠肺灌洗液、鼻灌洗液中均未检测到特异性Ig G抗体产生。4.无论是肌注免疫还是滴鼻免疫,环化PV2免疫组小鼠产生的中和抗体滴度均高于PV2免疫组小鼠,但低于F蛋白免疫组小鼠。所有滴鼻免疫组的小鼠血清中和抗体滴度明显低于肌注免疫组小鼠(P0.05)。5.环化的PV2肽不管肌注,还是滴鼻免疫小鼠后产生的血清抗体对于天然F蛋白的特异性识别能力优于PV2肽。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

免疫原,单克隆抗体,晶体结构,蓝色

ure 1-1. The crystal structure of the monoclonal antibody Motavizumab001 antigen derived from the RSV (blue: Motavizumab, red: FFL-001 pr，单克隆抗体 Motavizumab 与源于 RSV 免疫原 FFL_001 的晶体结构图（Motavizumab，红色：FFL_001 蛋白）。材料与方法料、主要试剂肽溶解液：20mM HEPES, pH 7.2, 0.1% Tween20, 15mM DTT、主要设备

The stable partion of the RSV F protei图 1-3，RSV F 蛋白中结构稳定部分。e crystal structure of the RSV F protein with the diff

非键作用,系统分析,抗体,盐桥

gure 1-6. Systematic analysis on the non-bonding interaction between otavizumab. There were nine H-bonding interactions and one sation. 1-6，系统分析 FFL-001 肽与 Motavizumab 抗体之间的非键作用。其现有 9 个氢键作用，一个盐桥作用。

【参考文献】