毒性质粒的丢失促进了宋内氏志贺菌与CD209和CD207之间的相互作用

发布时间：2020-07-12 21:36

【摘要】：【背景和目的】21世纪以来,在全球引起痢疾的主要病原体是宋内氏志贺菌,由于志贺菌耐受胃酸,极少量的志贺菌(10-100个)感染机体后,可穿透肠屏障,快速侵入结直肠引起强烈的炎症反应,导致细菌性痢疾。据流行病学研究报道,全世界每年菌痢发生例约有1.6亿,主要集中在5岁以下的儿童,全世界每年因痢疾而死亡的人数约达100万。最新文献表明,宋内氏志贺菌还可通过性传播途径感染,可编码志贺毒素,而且产超广谱β内酰胺酶的多重耐药宋内氏志贺菌与非结石性胆囊炎的发生密切相关。因此迫切需要从志贺菌本身特性以及致病机制方面进行研究。宋内氏志贺菌具有210 kb的毒性质粒,此质粒编码一种亲脂多糖(LPS)的O抗原基因簇。然而,这种毒性质粒在感染过程中却经常丢失。那么对宋内氏志贺菌来说,其感染的优势是否是丢失其毒性质粒?大多数革兰氏阴性的肠道细菌能表达完整的LPS(其结构由内而外包含脂质A、核心多糖core、O抗原三部分组成),细菌失去O抗原会变成为粗糙型菌落,也就是革兰氏阴性细菌在其表面表达了一个LPS core(LOS)。本实验室前期的研究结果表明,淋病奈瑟菌和鼠疫耶尔森氏菌等本身不表达O抗原的革兰氏阴性菌可通过LOS与CD209相互作用;另外假结核耶尔森氏菌和伤寒沙门氏菌等本身具有O抗原的病原菌在人为条件下不表达O抗原时,能够通过LOS与CD209相互作用侵袭抗原提呈细胞(APCs)。而宋内氏志贺菌在其复制过程中极易自然地丢掉O抗原合成基因进而暴露LPS core,那么宋内氏志贺菌是否也可通过这一方式可与机体免疫细胞相互作用呢?本研究从宿主-病原微生物相互作用的角度,提出了失去210kb的毒质粒的宋内氏志贺菌(rough)以其外膜蛋白核心寡糖的某些成分为配体,与宿主细胞表面一类C型凝集素受体相互结合,促进了宋内氏志贺菌对宿主细胞的黏附和侵袭,而在感染过程中这种相互作用很有可能有助于机体对粗糙型的宋内氏志贺菌进行清除,同时我们推测,可能也有很少一部分的宋内氏志贺菌能够利用和鼠疫耶尔森菌相同的感染机制侵入APCs并逃避免疫系统的监视。【方法】1.刚果红平板筛选宋内氏志贺菌光滑型和粗糙型利用宋内氏志贺菌在生长条件下可自然丢失毒性质粒的特性获得光滑型和粗糙型,运用刚果红可与细菌三型分泌系统(T3SS)编码的毒力蛋白结合进而验证,有毒株呈现红色菌落,而无毒株为无色菌落。2.基因检测宋内氏志贺菌光滑型和粗糙型选择编码宋内氏志贺菌的特有基因、210kb毒性质粒基因及O抗原编码基因设计引物,多聚酶链式反应(PCR)鉴定光滑型和粗糙型菌株。3.宋内氏志贺菌脂多糖LPS表型的分析提取并纯化细菌脂多糖LPS,用SDS-PAGE银染的方法检测细菌O抗原的表达情况。4.细胞侵袭实验3.1用大肠杆菌K12粗糙型CS180及表达O抗原的光滑型CS1861做对照,用宋内氏志贺菌光滑型Ss-WT及丢失毒性质粒后的粗糙型Ss-rough侵袭C57BL/6小鼠的腹腔巨噬细胞,利用庆大霉素保护实验观察细菌感染细胞1.5小时后丢失毒性质粒的粗糙型Ss-rough(无侵袭基因的无毒株)对巨噬细胞的侵袭能力。3.2用大肠杆菌K12粗糙型CS180及表达O抗原的光滑型CS1861做对照,用宋内氏志贺菌光滑型Ss-WT及丢失毒性质粒后的粗糙型Ss-rough侵袭人肠道分离的树突状细胞,利用庆大霉素保护实验观察细菌感染细胞1.5小时后丢失毒性质粒的粗糙型Ss-rough对树突状细胞的侵袭能力。3.3用大肠杆菌K12粗糙型CS180及假结核耶尔森氏菌Y1作为对照,用宋内氏志贺菌光滑型Ss-WT,丢失毒性质粒后的粗糙型Ss-rough及人工构建表达O抗原的宋内氏志贺菌roughO~+侵袭表达鼠CD209b,人CD209a和人CD207受体的CHO细胞,利用庆大霉素保护实验观察细菌感染细胞2小时后侵袭进入细胞内的菌量,确定宋内氏志贺菌粗糙型Ss-rough是否是通过与固有免疫细胞表面受体CD209/CD207相互作用进而进入抗原提呈细胞内的。5.细胞侵袭抑制实验用细菌脂多糖类似物及特异性的抗细胞表面分子抗体先与细胞相互作用,然后再进行侵袭实验,观察感染2小时后侵袭进入细胞内的菌量,以此确定宋内氏志贺菌丢失毒性质粒后的粗糙型Ss-rough与细胞表面受体是否为特异性相互作用,是否Ss-rough的脂多糖核心LPS core参与同CD209和CD207的相互作用。6.动物感染体内实验腹腔注射途径,用适当剂量的宋内氏志贺菌光滑型Ss-WT,丢失毒性质粒后的粗糙型Ss-rough及人工构建表达O抗原的宋内氏志贺菌roughO~+直接注射入腹腔感染C57BL/6小鼠,24小时后观察细菌在体内的播散情况。【结果】1.光滑型和粗糙型宋内氏志贺菌的筛选及鉴定利用刚果红平板法培养野生型宋内氏志贺菌,通过随机挑选若干菌落并用特异性引物鉴定得到了丢失毒性质粒的粗糙型宋内氏志贺菌Ss-rough。2.丢失毒性质粒后的宋内氏志贺菌不表达O抗原银染法结果表明,丢失毒性质粒后的宋内氏志贺菌Ss-rough不表达O抗原。3.丢失毒性质粒促进粗糙型宋内氏志贺菌侵袭小鼠腹腔巨噬细胞和人肠道树突状细胞宋内氏志贺菌光滑型Ss-WT和丢失毒性质粒的粗糙型Ss-rough均可侵入抗原提呈细胞,且与光滑型相比,丢失毒性质粒的粗糙型Ss-rough侵入抗原提呈细胞更多。4.CD209和CD207是粗糙型宋内氏志贺菌侵入抗原提呈细胞的受体与CHO细胞相比,宋内氏志贺菌粗糙型Ss-rough可侵入表达mCD209(mSIGNR1),hCD209(hDC-SIGN),hCD207(hLangerin)分子的CHO转染细胞系。表明粗糙型宋内氏志贺菌Ss-rough可与CD209和hCD207相互作用,而且O抗原可降低他们之间的相互作用。5.粗糙型的宋内氏志贺菌与CD209/hCD207的相互作用是特异性的抗CD209和抗hCD207单克隆抗体可抑制宋内氏志贺菌与CD209和hCD207之间的相互作用,但这种相互作用不能被甘露聚糖(细菌脂多糖类似物)所抑制。表明粗糙型宋内氏志贺菌Ss-rough与受体的相互作用是特异性的,但可能不是利用类似于鼠疫耶尔森的感染机制通过core LPS与受体相互作用的。6.表达O抗原可以降低粗糙型宋内氏志贺菌播散至肠系膜淋巴结和脾脏的能力通过对感染细菌24h后的小鼠内脏中的细菌数目进行比较,观察到宋内氏志贺菌丢失毒性质粒后仍能侵入周围组织,且O抗原可抑制粗糙型宋内氏志贺菌Ss-rough进入肠系膜淋巴结和脾脏。【总结】本研究证明了丢失毒性质粒后的宋内氏志贺菌可与C型凝集素受体CD209和CD207相互作用进入抗原提呈细胞内。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R378
【图文】：

志贺菌,脂多糖,鼠伤寒沙门氏菌,合成基因

33图 1. 大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和宋内氏志贺菌的脂多糖结构及其合成基因Figure 1. Structures of inner- and outer-core regions of the LPS orLOS of E. coli K12, S. typhimurium, and S. sonnei and the genes involved in their synthesis.

志贺菌,粗糙型,光滑型,基因

34图 2. PCR 鉴定光滑型和粗糙型宋内氏志贺菌（a）引物特异性针对宋内氏志贺菌基因（shigella），产物片段大小为 500bp; （b）引物为针对宋内氏志贺菌毒性质粒上编码 O 抗原的基因（wzy），产物大小为234bpFigure 2. The smooth type and rough type were identified by PCR（a） the primer is the specific shigella genes; （b）The primer is O antigen codinggene (wzy) on the plasmid.注：图中阳为宋内氏志贺菌阳性对照；ST 为鼠伤寒沙门氏菌。

志贺菌,表型分析,脂多糖,银染

35图 3. SDS-PAGE 银染对宋内氏志贺菌脂多糖表型分析Figure 3. Analysis of LPS phenotype of S. sonnei注：图中 CS180 是不表达 O 抗原的大肠杆菌；CS1861 是将 pSS37（携带痢疾志贺菌的 O 抗原全部基因）转入 CS180 的大肠杆菌，可表达 O 抗原；Ss-rough 是丢失毒性质粒后的宋内氏志贺菌，不再表达 O 抗原；Ss-WT 是野生型宋内氏志贺菌，具有毒性质粒，表达 O 抗原；roughO+是是将 pSS37（携带痢疾志贺菌的 O 抗原全部基因）转入 Ss-rough 的宋内氏志贺菌，不含有毒性质粒，可表达 O 抗原。

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