人脂肪干细胞来源外泌体促进脂肪干细胞成骨分化的作用研究

发布时间：2020-07-14 00:33

【摘要】：目的:提取并鉴定人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,ADSCs)不同成骨分化阶段的外泌体(hADSC-Exos),探究hADSC-Exos促进成骨分化的适宜提取时间及作用浓度,证明其能够进入hADSCs内进行调控。研究方法:酶消化法分离培养原代hADSCs并进行鉴定;超速离心法提取hADSCs未成骨诱导(Exo0),成骨诱导1~14d(Exo14)及15~28d(Exo28)的外泌体,并采用透射电镜,Western Blot,动态光散射法进行鉴定;使用茜素红染色检测比较3种hADSC-Exos促进原始hADSCs成骨分化的能力;PKH67标记Exo14检测hADSCs对其摄取的能力;CCK-8和划痕法分别检测三种不同浓度(10、15、20μg/ml)Exo14对hADSCs增殖及迁移能力的影响;Western Blot检测不同浓度Exo14对hADSCs成骨相关蛋白表达的作用。结果:实验所获取的hADSCs符合间充质干细胞鉴定标准。透射电镜及动态光散射结果表明所获取的外泌体具有典型的外泌体形态特征,Western Blot检测外泌体CD63,CD9呈阳性表达。茜素红染色表明培养21d后,Exo14组矿化结节含量明显高于Exo28组。PKH67标记的外泌体能够被hADSCs摄取进入细胞,聚集在细胞核周围。CCK-8表明培养24h,48h外泌体对细胞增殖能力无影响,至72h,15μg/mlExo14明显促进hADSCs增殖;划痕实验表明培养至12h外泌体组明显高于阴性对照PM组(P0.01),且随外泌体浓度增加促细胞迁移能力呈递减趋势但统计学分析无意义(P0.05)。Western Blot检测共培养3d,Exo14组成骨相关蛋白ALP,RUNX2呈阳性表达,结果表示15μg/mlExo14组促RUNX2表达能力与成骨诱导液组(阳性对照组)相当,蛋白表达明显高于10μg/mlExo14组(0.583±0.045)和20μg/mlExo14(0.499±0.010)。结论:hADSCs成骨诱导1~14d分泌的外泌体Exo14能够被原始的hADSCs高效摄取并且进入细胞内独立作用诱导hADSCs成骨分化。较低浓度的Exo14即可促进hADSCs增殖,迁移,成骨分化,并且最适宜作用浓度为15μg/ml。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2
【图文】：

中国医科大学硕士学位论文3 实验结果3.1 hADSCs 形态学观察原代 hADSCs 接种 48h 后基本贴壁生长，细胞由圆形伸展为长梭形或多角形（图 1A）。传至 4 代可见细胞生长良好，融合达 80%以上，细胞呈集落式旋涡状生长，大小均一，排列紧密，边缘清晰（图 1B）AB

中国医科大学硕士学位论文3.3 hADSCs 多向分化能力鉴定hADSCs 成骨诱导后细胞呈复层聚集生长，逐渐变为多角形或不规则形，表面突起增加连接邻近细胞，胞质内可见黑色颗粒，细胞间可见矿化的基质。诱导21d后茜素红染色可见大量红色矿化结节hADSCs成脂诱导后细胞逐渐变为椭圆形，体积增大，诱导 14d 后油红 O 染色可见较多亮红色的聚集圆形脂滴；hADSCs成软骨诱导后细胞逐渐变为圆形，诱导 28d 后阿利辛蓝染色可见软骨组织中呈蓝色的内酸性粘多糖。A B C

图 4.人脂肪干细胞来源外泌体电镜鉴定A：黑色箭头所指为Exo0（6000X）；B:黑色箭头所指为Exo14（4000X）;C:黑色箭头所指为Exo28（4000X）。图中Exo0:hADSCs未分化阶段分泌的外泌体；Exo14：hADSCs成骨分化 1~14d分泌的外泌体；Exo28:hADSCs成骨分化 15~28d分泌的外泌体。3.5 hADSCs-Exos 粒径分析使用马尔文粒度仪动态光散射法测量纳米颗粒粒径，结果显示 hADSCs-Exos平均直径为 125.8nm,粒度分布系数（polydispersity indexes，PDI）为 0.282，结果质量良好，符合外泌体粒径标准。

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本文编号：2754205