奶牛与人生殖道病毒群落解析、比较及新发病毒遗传特征研究

发布时间：2020-07-15 12:22

【摘要】：近年来随着微生物学研究的深入开展,越来越多的新发致病性微生物与临床疾病的发生、发展紧密相关。病毒作为微生物的一种,它也会对动物以及人类的健康构成威胁。随着社会发展,人类的活动日益频繁,经贸往来、跨国旅游、城市化进程以及森林砍伐等不断加剧导致了病毒性的疾病爆发的风险持续增加。同样,新型病毒感染导致的疾病也越来越多。报道显示,有些病毒可以在动物体内长期潜伏存在而不会导致动物明显的临床症状,但如果病毒发生跨种间动物传染至人则会产生较为严重的临床症状,比如人类免疫缺陷病毒(HIV)、SARS病毒、MERS病毒等。因此,解析动物以及人体内特定微环境病毒的构成、比较两者之间病毒组成的差异,并挖掘其中潜在具有致病性的新型病毒具有重要的公共卫生学意义。目前传统的病毒分析方法如细胞培养、电镜观察、PCR、ELISA等方法对于新型病毒的发现和检测具有较大的局限性。随着下一代测序技术的出现和生物信息学的发展,病毒宏基因组学(Viral metagenomics)应运而生。病毒宏基因组学是以特定环境中全部病毒基因的总和─包括全部真核生物病毒和原核生物病毒(噬菌体)核酸为研究对象,以不依赖于有机体培养的技术手段,对该环境样品中病毒多样性、种群结构、互作关系进行全面研究的新型病毒学研究方法。该方法突破了传统方法对于病毒研究的限制,可以有效地用于特定样品病毒群落解析。为了探究和比较奶牛与人生殖道微环境内病毒群落构成,并挖掘生殖道微环境内新型病毒,本研究采用病毒宏基因组学的方法对奶牛与人的生殖道拭子样本构建病毒宏基因组文库,采用Illumina Miseq测序平台进行测序,深入分析文库内病毒基因序列并形成病毒群落结构。本课题研究的主要内容包括:(一)奶牛生殖道病毒组研究对采集的80份健康奶牛生殖道拭子样品病毒群落解析,结果显示奶牛生殖道病毒群落在科水平上包括:双链DNA(ds DNA)病毒:腺病毒科(Adenoviridae)0.0797%、囊泡病毒科(Ascoviridae)0.5503%、杆状病毒科(Baculoviridae)0.3068%、疱疹病毒科(Herpesviridae)5.7212%(其中包含异疱疹病毒科Alloherpesviridae0.0746%)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)1.1159%、多瘤病毒科(Polyomaviridae)0.1029%、痘病毒科(Poxviridae)38.4279%。双小RNA病毒科(Picobirnaviridae)0.0771%。反转录病毒科(Retroviridae)0.7688%。单链DNA(ss DNA)病毒:圆环病毒科(Circoviridae)8.6781%、Genomoviridae病毒科7.035%、细小病毒科(Parvoviridae)0.2237%、小环状DNA病毒科(Smacoviridae)8.3027%、分类不明的单链DNA病毒(Unclassified ss DNA Virius)27.1657%。ss RNA病毒:星状病毒科(Astroviridae)0.0180%、冠状病毒科(Coronaviridae)1.2162%、小RNA病毒科(Picornaviridae)0.0103%。未分类的RNA病毒(Unclassified RNA Virius)0.198%。奶牛生殖道病毒群落的组成特点:(1)病毒群落组成多样性高。(2)其中哺乳动物病毒序列占比高达65.2945%。(3)包含1株新型乳头瘤病毒(Papillomavirus)。(4)包含2种牛多瘤病毒bovine polyomaviruses。(5)包含6株新型CRESS-DNA病毒。(二)人生殖道病毒组研究对采集的100份人阴道拭子病毒群落进行解析,结果显示人阴道病毒群落在科水平上的构成是:双链DNA(ds DNA)病毒:囊泡病毒科0.1173%、杆状病毒科0.2346%、疱疹病毒科0.2346%、乳头瘤病毒科51.1928%、痘病毒科2.3465%。反转录病毒科15.4869%。肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)0.0782%。单链DNA(ss DNA)病毒:指环病毒科(Anelloviridae)29.2912%、细小病毒科0.0391%。单链RNA(ss RNA病毒):星状病毒科0.0391%、小RNA病毒科0.8604%和一些分类不明的单链DNA病毒(Unclassified ss DNA Virius)0.0391%。未分类的RNA病毒0.0391%。人阴道病毒群落的组成特点:(1)病毒序列丰度高。(2)其中哺乳病毒序列占比达99.6872%。(3)包含1株新的人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)。(4)包含3株新型指环病毒(Anellovirius)序列。(三)奶牛与人生殖道病毒群落的比较奶牛与人生殖道病毒群落在构成上具有相同点亦有差异之处,主要表现在,奶牛生殖道病毒群落多样性大于人生殖道病毒群落。人生殖道内存在指环病毒,而奶牛生殖道不含此类病毒。(四)新型病毒的发现及其系统进化分析(1)新型乳头瘤病毒在奶牛生殖道拭子Cattle S02号文库以及人生殖道拭子LVS02号文库中分别发现一株新型乳头瘤病毒。乳头瘤病毒科家族具有高度多样性,该病毒是双链环状DNA病毒,大小约为8kb,具有高度保守的开放阅读框(ORF)L1区。在奶牛生殖道Cattle S02号文库中发现的新型乳头瘤病毒命名为bovine papillomavirus ujs-21015,全长7398bp,包含早期基因E6(1-426bp)、E7(428-751bp)、E1(738-2564bp)、E2(2506-3747bp)和晚期基因L1(5376-6887)、L2(3828-5369bp)以及长链非编码区LCR(6888-7389),基于L1蛋白质序列的系统发育分析显示,该毒株属于Dyoxipapillomavirus病毒属内的新种(species)。在人生殖道LVS02号文库中发现的新型乳头瘤病毒命名为new HPV全长7354bp,包含早期基因E7(195-494)、E1(475-2379)、E2(2321-3487)和晚期基因L2(3551-5164)和L1(5085-6710),同样基于L1蛋白的系统发育分析显示该毒株是Gammapapillomavirus病毒属内的新种(species)。(2)新型CRESS-DNA病毒CRESS-DNA病毒是能够编码蛋白的一类环形的单链DNA病毒,它主要编码的蛋白有Rep蛋白和Cap蛋白。CRESS-DNA这一类病毒包含有Circoviridae、Geminiviridae、Nanoviridae等。本研究在奶牛生殖道病毒组文库中发现6株新型CRESS-DNA病毒,分别命名为C0101(2,255 bp)、C05001(2,562 bp)、C042793(2,958bp)、C021765(2,727 bp)、C025899(2,734bp)、C013782(3,085bp),其中C0101、C05001和C042793与圆环病毒科(Circoviridae)中的部分病毒相似,C021765和C025899与环状病毒相似,C013782与Genomoviridae中的gemycircularvirus相似。(3)多瘤病毒在奶牛生殖道拭子Cattle S05号文库中发现多瘤病毒基因序列,经过比对发现文库中含有两株不同的多瘤病毒毒株,分别与多瘤病毒BPy V1(KM496323)和BPy V2(KX455486)具有较近的亲缘关系。多瘤病毒在哺乳动物和鸟类中分布广泛,大部分哺乳动物的多瘤病毒可以导致有免疫力的宿主存在持续性的无症状感染,部分多瘤病毒经过研究发现可以致病免疫力低下的宿主。本次研究在奶牛生殖道发现的多瘤病毒BPy V1和BPy V2之前在牛肉中也被发现过,目前对于该病毒在宿主中是否存在于其它部位尚不清楚,本次在奶牛生殖道中发现这两株病毒可能对于该病毒的传播方式有一定的提示意义。(4)新型指环病毒人生殖道病毒群落内含有高丰度的指环病毒序列,经过生物信息学分析后得到3株指环病毒基因组中的最大开放阅读框(ORF1),3株指环病毒序列分别命名为ujs0601、ujs0801、ujs0804,经过比对后确认该3株均为新型指环病毒序列。指环病毒为单链环状DNA病毒,主要包括3个编码区,目前研究认为ORF1所编码的蛋白在基因组复制的过程中起作用。指环病毒是广泛存在于人的体液当中。该病毒与疾病的关联性还不是十分清楚,有待于将来基于特定疾病的流行病学研究来阐明其与生殖道相关疾病的关联性。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373;S852.65
【图文】：

路线图,病毒,路线,宿主

图 1.1 病毒宏基因组学研究路线Fig.1.1 The research route of viral metagenomics学已经成为从临床样本中发现新病毒的最有力工用病毒宏基因组学方法。作为一种无偏差（unb毒宏基因组学的方法容易受到低病毒-宿主e ratios）等因素的影响[28, 29]。在有些样品中病毒样品中存在的细菌和真核生物的核酸，这些因素此，富集病原体的遗传物质和消除宿主本身遗传如今有一系列的病毒富集方法包括物理方法和酶如通过反复冻融裂解细胞释放病毒粒子，通过不 μm）和离心，酶消化宿主基因组等[30-33]。

分布情况,文库,病毒

2.2 病毒宏基因组文库质量控制及结果分析2.2.1 病毒宏基因组文库质量控制我们利用 1%琼脂糖凝胶电泳来观察文库筛选前后的 DNA 片段分布情况。如图2.1 所示：A 图当中 1-5 代表的是奶牛生殖道拭子病毒宏基因组文库 CattleS01-CattleS05，6-15 代表的是人生殖道拭子病毒宏基因组文库 LVS01- LVS10。B 图是文库混合后经过筛选纯化后的电泳结果。

生殖道,病毒组,奶牛,亚科

图 2.3 奶牛生殖道病毒组构成-科水平Fig.2.3 The virome composition of bovine genital tract- Family属水平上：链 DNA（dsDNA）病毒：腺病毒科中含有 Aviadenovirus、Mastadeno科中含有 Ascovirus、Toursvirus；杆状病毒科中含有 Alphabacuculovirus ；疱疹病毒科中含有 Cyprinivirus 和 Alloherpesverpesvirinae、Gammaherpesvirinae 三个亚科，其中 Gammaherpesvirinaacavirus 和 Rhadinovirus；乳头瘤病毒科中含有 Dyokappapillomavirus 以乳头瘤病毒科；分类不明的多瘤病毒科；痘病毒科中含有 Chordopoxvpoxvirinae 两个亚科，除了这两个亚科中分类不明的，其中 Chordop有 Avipoxvirus、Orthopoxvirus、Parapoxvirus，Entomopoxvirinae 亚科ntomopoxvirus、Betaentomopoxvirus。 RNA 小病毒科中含有 Picobirnavirus。

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