ICP4促进miR-101表达及miR-101调节HSV-1复制机制的研究

发布时间：2020-07-16 23:43

【摘要】：【目的】micro RNAs(mi RNAs)是一种内源性18~26 nt的单链非编码小分子RNA,在动植物体内通过靶定编码基因m RNA 3’UTR区域直接进行转录后调控从而发挥其基因表达调控功能。已有研究表明宿主细胞mi RNAs参与了病毒感染后的抗病毒免答效应,另一方面病毒感染还可引起宿主细胞内mi RNAs的表达升高或降低,宿主细胞mi RNAs与病毒感染之间存在着密切的相关性。本项目前期实验结果表明HSV-1感染He La细胞后mi R-101表达水平显著升高,并且初步确定mi R-101通过直接靶定并下调COX2(Cyclooxygenase 2)和GRSF1(G-rich RNA sequence binding factor 1)可能对HSV-1的复制产生影响。成熟的mi R-101有两个前体,为pre-mi R-101-1和pre-mi R-101-2,分别位于1号和9号染色体上,本实验室前期工作证明HSV-1感染后mi R-101的表达水平升高,以pre-mi R-101-2来源为主。因此本文拟从HSV-1诱导hsa-mi R-101-2表达升高的现象出发,深入研究HSV-1感染后宿主细胞hsa-mi R-101-2显著升高的具体机制,以及mi R-101对HSV-1复制的具体调控作用机制,深入阐明宿主细胞mi RNA与HSV-1之间的相互作用关系。【方法】本文主要从HSV-1感染后宿主细胞mi R-101显著升高的具体机制,以及mi R-101对HSV-1复制的具体调控作用机制两方面进行:1.首先通过双荧光素酶报告系统实验确定HSV-1对hsa-mi R-101-2启动子的具体作用方式,确定导致hsa-mi R-101-2启动子活性变化的HSV-1编码的作用因子。然后通过q RT-PCR实验检测该作用因子对hsa-mi R-101-2及其宿主基因表达水平的影响,进一步确定该作用因子对hsa-mi R-101-2的具体调控方式。最后通过染色质免疫共沉淀实验,凝胶电泳迁移实验确定作用因子是否作为转录因子与hsa-mi R-101-2启动子发生直接或间接的相互作用。2.首先通过病毒滴定,免疫荧光,western blot等实验进一步确定mi R-101的直接靶基因COX2和GRSF1对HSV-1复制的具体作用。然后通过q RT-PCR确定COX2对干扰素表达水平的影响;并通过western blot,RNA免疫共沉淀及凝胶电泳迁移实验确定GRSF1促进HSV-1衣壳蛋白表达的具体作用方式,最终确定COX2和GRSF1影响HSV-1复制的具体分子途径。【结果】1.双荧光素酶报告系统实验结果表明HSV-1感染后,hsa-mi R-101-2启动子活性显著增强;2.双荧光素酶报告系统实验结果表明过表达HSV-1即刻早期蛋白ICP4可以促进hsa-mi R-101-2启动子活性,q RT-PCR实验结果显示过表达ICP4可以促进hsa-mi R-101-2及其宿主基因的表达;3.染色质免疫共沉淀实验(Ch IP)及凝胶电泳迁移实验(EMSA)结果表明ICP4可以直接结合hsa-mi R-101-2启动子序列;4.病毒滴定实验,免疫荧光实验,western blot实验结果表明GRSF1可以促进HSV-1复制,而COX2可以抑制HSV-1复制;5.qRT-PCR实验结果表明COX2可以促进I/III型干扰素的表达;6.Western blot实验结果表明GRSF1可以促进HSV-1衣壳蛋白p40的表达水平;7.RNA免疫共沉淀实验及RNA凝胶电泳迁移实验结果表明GRSF1可以与p40的m RNA直接结合。【结论】通过对本课题的深入研究,具体可以得到以下3个结论:1、HSV-1通过其即刻早期蛋白ICP4诱导hsa-mi R-101-2的表达升高,ICP4可以直接结合hsa-mi R-101-2启动子序列并作为转录因子激活其转录活性。2、mi R-101的直接靶基因COX2可以通过促进I/III型干扰素的表达从而抑制HSV-1的复制。3、mi R-101的直接靶基因GRSF1可以通过结合HSV-1衣壳蛋白p40的mRNA促进其翻译表达,从而促进HSV-1的复制。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373
【图文】：

启动子序列,9号染色体,启动子,内含子

1.2 结果1.2.1 HSV-1 诱导 hsa-miR-101-2 启动子转录活性升高本实验室前期工作证明 HSV-1 感染后 miR-101 的表达水平升高，以pre-miR-101-2 来源为主，相关性分析发现 pre-miR-101-2 与其宿主基因 RCL1 表达呈正相关，表明其具有相同启动子。本实验室前期工作已经成功构建hsa-miR-101-2 启动子序列(图 1)，并证明其具有启动子活性。前期工作中我们构建了多段启动子序列，在此我们选择了 p1060，p421，p334 为研究对象，作深入分析(图 1)。

启动子活性,启动子,双荧光,报告系统

图 2 HSV-1 促进 hsa-miR-101-2 启动子活性的确定在 HeLa 细胞中转染启动子质粒，12 h 后感染 HSV-1 病毒(MOI=0.01)，双荧光素酶报告系统实验检测荧光素酶活性。A. 病毒感染 4 h 后 hsa-miR-101-2 启动子荧光素酶活性。B. 病毒感染 8 h 后 hsa-miR-101-2 启动子荧光素酶活性。C. 病毒感染 24 h 后 hsa-miR-101-2 启动子荧光素酶活性。*，p<0.05，**，p<0.01。每组设有三个复孔。1.2.2 ICP4 诱导 hsa-miR-101-2 启动子转录活性及其表达水平升高前期实验结果表明 HSV-1 感染早期 miR-101 的表达显著升高，并且可以促进 hsa-miR-101-2 的启动子活性，因此我们拟深入研究分析 HSV-1 编码的蛋白中可能的相关调控因子，并且将目标选定在 HSV-1 编码的即刻早期蛋白范围内，通过参考文献及相关生物信息学分析，我们选择了 HSV-1 的即刻早期蛋白 ICP4作为研究对象，进一步研究 HSV-1 是否通过 ICP4 直接调控 hsa-miR-101-2 的表达。首先我们应用基因克隆的方法分别构建了 ICP4 过表达和干扰质粒。

序列,过表达,标签,N端

EcoR I 之间连入三连 Flag (3×Flag)标签，在 EcoR I 和 Xho I 中间插入 PCR 扩增所得 ICP4 CDS 序列 (3.9 kb) (图 3A)。通过单酶切鉴定有 9.3 Kb 左右的酶切片段(载体和目的片段全长) (图 3B)，并经测序公司测序后与其 CDS 序列比对正确，证明 pcDNA3-3×Flag/ICP4(以下简称 pFlag-ICP4)质粒构建成功。将pFlag-ICP4 及其对照 pcDNA3 转染 HeLa 细胞，转染后 48h 裂解蛋白，western blot检测其蛋白的表达水平。结果显示，pFlag-ICP4 可以有效表达 ICP4， (图 3C)。证明 ICP4 过表达质粒有效，可以进行下一步实验。

【共引文献】