干酪乳酸杆菌代谢物对白假丝酵母菌生物被膜体外抑菌效果及分子机制的研究

发布时间：2017-03-30 02:19

  本文关键词：干酪乳酸杆菌代谢物对白假丝酵母菌生物被膜体外抑菌效果及分子机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的随着癌症放、化疗和器官移植患者的增加,免疫抑制剂和广谱抗生素的大量使用以及医学植入装置如导尿管、人工心瓣膜和置换关节等医学材料使用的增多,以白假丝酵母菌为代表的念珠菌感染率和病死率均逐年快速增长,约占医源性感染的50%。生物被膜是粘附于活体或非活体组织表面,由自身产生胞外多聚基质(extracellular matrix, ECM)包裹的具有三维立体结构的菌细胞群体。生物被膜是微生物主要的生存方式,和浮游细胞相比,80%的微生物感染是由生物被膜引起的。生物被膜作为天然屏障可显著降低白假丝酵母菌对抗真菌药物的敏感性,产生高度耐药和持续感染。研究表明,白假丝酵母菌生物被膜对常见的抗真菌药物存在明显的耐药性,如两性霉素B、氟康唑、特比萘芬、制霉素等。生物被膜形成后药物的50%抑菌浓度可增加到原来的10倍,而80%抑菌浓度将增加到原来的30到2000倍,极大地限制了生物被膜相关感染的防治。与治疗细菌感染相关的庞大的、多门类的抗生素家族不同,抗真菌药物的选择具有很大的局限性。唑类在浅表性真菌感染的应用极为广泛,但自身的毒性作用不容忽视,而且真菌对其耐药性已广泛存在。以卡泊芬净为代表的棘白菌素类药物可以抑制细胞壁p-1,3-葡聚糖的合成,虽然对生物被膜感染极为有效,但也存在抗真菌谱窄的缺憾。因此寻找高效、广谱、无毒的抗真菌药物是临床上亟待解决的难题。乳酸杆菌是一种革兰氏阳性益生菌,它广泛存在人体胃肠道、泌尿系统、生殖系统和口腔等。乳酸杆菌通过发酵碳水化合物、蛋白质、氨基酸、脂类等产生多种代谢物。其中,乳酸、过氧化氢及细菌素具有抗菌作用。据文献报道,乳酸杆菌代谢产物对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌有抑菌作用,并且对人体无毒副作用。因此,乳酸杆菌代谢物非常有潜力开发作为治疗白假丝酵母菌生物被膜感染的非抗生素类药物。目前国内外并没有干酪乳酸杆菌代谢物对体外白假丝酵母菌生物被膜抑菌效果和抑菌途径的报道。本实验将检测干酪乳酸杆菌代谢物是否对体外白假丝酵母菌生物被膜具有抑菌作用,并且通过蛋白组学技术进一步研究干酪乳酸杆菌代谢物的抑菌机制。方法1.将含有干酪乳酸杆菌代谢物的固体培养基捣碎,通过萃取、蒸馏的方式浓缩干酪乳酸杆菌代谢物。2.采用XTT减低法测定干酪乳酸杆菌代谢物对白假丝酵母菌游离态及生物被膜态的最小抑菌浓度(MICso)。3.定量检测不同浓度的干酪乳酸杆菌代谢物对白假丝酵母菌生物被膜形成、成熟阶段的体外代谢活动的影响。4.通过时间杀菌曲线检测干酪乳酸杆菌代谢物的浓度和作用时间对白假丝酵母菌生物被膜的影响。5.在干酪乳酸杆菌代谢物的刺激下,使用倒置显微镜观察白假丝酵母菌酵母相向菌丝相的形态学转变。6.梯度微量稀释法(棋盘法)检测干酪乳酸杆菌代谢物与两性霉素B的联用对白假丝酵母菌生物被膜的体外抑菌效果。7.实时定量PCR检测干酪乳酸杆菌代谢物对白假丝酵母菌中ALS1、ALS3、 HWP1、BCR1、EFG1、TEC1六种基因的差异表达。8.采用双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技术对比干酪乳酸杆菌代谢物处理前后白假丝酵母菌蛋白质的表达差异,利用MALDI-TOF-TOF质谱仪对差异蛋白进行分析,通过BioTools软件搜索NCBI数据库,明确蛋白质的名称和作用。结果1.干酪乳酸杆菌代谢物作用于白假丝酵母菌浮游细胞、生物被膜的MIC80分别为1：256和1：128。菌株YEM30对干酪乳酸杆菌代谢物敏感,代谢物的体外抑菌活性较强。2.干酪乳酸杆菌代谢物可以抑制白假丝酵母菌生物被膜的形成和成熟的生物被膜,抑菌效果与代谢物的浓度正相关。3.干酪乳酸杆菌代谢物明显抑制生物被膜中白假丝酵母菌的代谢活性,随着药物浓度的升高,抑菌作用明显增强。4.干酪乳酸杆菌代谢物可以阻断白假丝酵母菌形态学的转变并呈现出浓度依赖性。随着干酪乳酸杆菌代谢物浓度的升高,白假丝酵母菌量减少、菌丝的生长受到不同程度的抑制。5.干酪乳酸杆菌代谢物单用或与AMB联用时,药物的抑菌率从50%提升至84%。两药联用能够减少AMB的使用剂量,降低药物的毒副作用,从而达到理想的治疗效果。6. ALS1、ALS3、HWP1、BCR1、EFG1、TEC1六种基因在干酪乳酸杆菌代谢物处理前后的表达量并没有出现显著变化,无统计学意义。7.从双向电泳图谱上获得6个显著蛋白斑点,对其中4个进行鉴定。在干酪乳酸杆菌代谢物的刺激下,烯醇酶(Eno1)、苹果酸脱氢酶(Mdhlp)、泛素连接酶(Ubrl)表达升高,己糖激酶(HK)表达下降。结论干酪乳酸杆菌代谢物对白假丝酵母菌生物被膜的形成和成熟两个阶段均存在抑制作用,并能干扰白假丝酵母菌酵母相向菌丝相的转变。表达量上调的烯醇酶、苹果酸脱氢酶、泛素连接酶和下调的己糖激酶通过参与免疫应答、群体感应、菌丝生长的途径来抑制白假丝酵母菌生物被膜的形成。综上所述,干酪乳酸杆菌代谢物作为非抗生素类抗真菌药物具有潜在的应用价值。
【关键词】：白假丝酵母菌 生物被膜 干酪乳酸杆菌代谢物 抑菌作用 双向电泳
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R379
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-15
• 前言15-18
• 实验材料18-22
• 实验方法22-31
• 实验结果31-36
• 讨论36-39
• 结论39-40
• 综述40-49
• 参考文献49-56
• 致谢56-57
• 攻读硕士学位期间发表论文目录57-58
• 附件58

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本文编号：276009