小动物无创超声脑神经调控方法研究

发布时间：2020-07-19 11:31

【摘要】：老年痴呆症、帕金森、癫痫和抑郁症等病症是长期危及患者健康且难以治愈的脑功能疾病。探索脑功能疾病的发病机制和发明有效的诊疗方法是领域内的紧迫需要。神经调控技术是开展神经科学研究与探索脑功能疾病诊疗方法的基本手段。当今主流的大脑神经调控方法包括化学药剂法、深脑电刺激法(DBS)、经颅直流电刺激法(tDCS)、经颅磁刺激法(TMS)和光感基因法。这些方法各具优缺点,却仍没有方法可以同时实现无创和全脑精确定位等功能。例如化学药剂法简单易用,但其作用靶向性差、药副作用大,且容易出现药耐受。DBS虽然空间分辨力高,但属于有创方法。tDCS和TMS虽然均属无创方法,但均具有穿透深度浅、空间分辨力低的不足。光感基因法虽然具有极高空间分辨力,但需依托基因操控,难以实现临床转化。因此,同时具备无创、高时空分辨力以及可全脑大范围定位等优点的神经调控方法是临床脑功能疾病治疗的研究热点。超声波属于机械波,无电离辐射,可无创穿透软组织甚至颅骨,可对靶点组织实施机械振动、热、空化或辐射力等多种声学物理作用。近年来,已经有学者利用超声波对外周神经甚至大脑实施刺激研究,并证实低强度经颅聚焦超声波具有神经调控功能,有望满足无创、高时空分辨力以及可全脑大范围定位的神经调控需求。目前,领域内已采用荧光成像、电生理、微透析、功能磁共振成像、葡萄糖代谢成像和行为响应测量等多种评估方法,对各种实验对象,包括神经元、离体神经干、离体脑片、小鼠、大鼠、迷你猪、兔子、羊、猴子和人,开展多项神经调控研究。上述实验结果已经证明了超声神经调控技术的有效性,但超声神经调控的作用机制仍未明晰;神经调控的参数和实验范式尚未成熟;针对神经系统疾病的治疗方案尚不完善。为了推动超声神经调控技术由科学假设演变成临床应用,针对实验动物的超声神经调控实验研究还应被广泛开展。通过在科学网统计近十年来神经科学领域以实验动物作为研究对象的科研论文成果发现,选择大鼠和小鼠做为实验对象的论文的比例分别是49%和37%。由此可见,啮齿动物是神经科学研究的主要动物类型,早期的超声神经调控研究也应主要基于啮齿动物开展,尤其是小鼠。因为小鼠具有疾病模型种类齐全(例如基因改造小鼠)、基础研究资源丰富、行为学研究便捷和便于饲养等优点。然而,当前基于小鼠的超声神经调控实验存在两大技术瓶颈。其一,常规超声神经调控实验所用的超声探头体积太大,导致实验小鼠须被麻醉并固定头部,从而严重影响了正常神经调控结果的评估,也限制了涉及认知和行为学实验的开展;其二,低频超声的作用靶点过大(例如0.5 MHz超声,-3 dB靶点直径可达8mm),而小鼠大脑的尺寸较小(宽约10mm),因此采用常用的低频超声难以准确对特定大脑核团开展刺激研究,更难以对神经网络开展多点调控研究。针对上述瓶颈问题,本课题确立了如下三个研究目标:目标一:设计并加工微型头戴式超声刺激装置,用于对清醒的、可自由活动的小鼠实施超声神经刺激,并针对运动行为学开展无创调控研究。为探索超声刺激对神经系统的作用机制以及对动物行为的调控作用,提供新方法、新工具。目标二:减少超声声学作用的焦点尺寸,提高空间分辨力,探讨高频超声(5MHz)刺激小鼠大脑的可行性,并建立不同脑区对神经调控的反应关系。实现更精准的神经调控,为研究超声频率对神经调控的影响提供数据。目标三:设计并加工新型阵列超声刺激系统,实现靶点可视化定位及双靶点神经刺激。为研究神经调控的网络调控功能提供工具,为设计新一代的刺激、评估一体的神经调控系统提供思路。结合上述研究目标,本文分别阐述了如下三方面的研究工作及意义:研究一:设计并加工了微型头戴式超声刺激装置,验证了对自由活动的清醒小鼠实施神经调控的功能,实现了超声作用下的原位脑电采集,并开展了针对行为学的调控研究。该装置的核心部分为超声刺激器,主要部件包括小型的压电陶瓷片、凹形环氧声透镜、外壳和插座部件。应用该刺激装置刺激小鼠的初级体感皮层的桶状区域可诱发原位记录的动作电位,并且可以引起小鼠的转头行为。实验结果表明,头戴式刺激器神经调控的方法可实现基于自由活动小鼠的无创超声神经调控,该方法解除了常规超声系统对实验动物的肢体限制和麻醉药剂对神经调控结果的干扰,为基于清醒可自由活动动物的超声神经调控研究提供新的方法和工具。研究二:分别用1MHz和5MHz超声对同一组小鼠实施超声脑刺激,并通过定量比较尾部肌电信号和分析肢体动作视频的方法评估刺激效果。结果表明,5 MHz超声可成功实现神经刺激,5 MHz超声刺激的等效直径(0.29±0.08 mm)明显小于1 MHz超声(0.83±0.08 mm);5 MHz超声刺激的潜伏期(45±31 ms)也小于1 MHz超声(208±111 ms)。可见,高频超声(5 MHz)极有可能用较小的刺激靶点成功激活小鼠的某些神经环路,并改善神经刺激的解剖特异性。该结果为改善超声神经调控空间分辨力提供思路,为设计超声神经调控参数补充参考数据,为发现和研究小尺度超声敏感的大脑核团提供方法和工具。研究三:结合“研究二”的实验结果,设计并搭建了可实现成像引导的双靶点超声神经调控新系统。该系统可通过对5 MHz阵列超声探头进行双焦点的切换控制实现对小鼠双靶点交替脑刺激,靶点的位置可由同一探头所形成的B超成像预先定位。刺激效果通过肌电信号和动作视频评估。该研究可为基于超声成像引导的多靶点神经调控研究提供方法和工具。总之,本研究为解决针对小动物的超声神经调控研究所遇到的瓶颈问题,展开了声学和电学的相关理论分析,研制了头戴式超声神经调控装置和成像引导的双靶点超声刺激系统样机,并基于搭建的装置和系统开展了小鼠神经调控研究。该研究结果不仅为探索超声神经调控机制提供了参考数据,而且为拓展超声神经调控实验研究提供新的方法和工具。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R-33;R741
【图文】：

神经调控,优缺点,主流,方法

中国科学院大学博士学位论文──小动物无创超声脑神经调控方法研究经颅电刺激和经颅超声刺激等非侵入式方法，以及电极深部脑刺激、光感基因和红外神经刺激等侵入式方法（Naor，2016）。1.1.2 常用的神经调控方法继 1870 年德国科学家报道了电刺激犬的大脑皮层可引发特定的躯体反应之后的 100 多年里，电、磁、光等技术与神经科学相结合产生了电极深部脑刺激、经颅磁刺激、光基因调控等神经刺激与调控技术（Lewis，2016）（如图 1.1 所示）。

离体,小鼠,脑细胞,共聚焦显微镜

中国科学院大学博士学位论文──小动物无创超声脑神经调控方法研究振动频率的不同，超声波可不同程度地无创穿透颅骨。频率越低，穿透颅骨的效率越高。实验研究表明（Clement，2002），频率小于 650kHz 的超声波具有较好的人体颅骨穿透效果，有望实现无创神经调控的功能。

示意图,神经调控,超声探头,参数计算

1.2 低频低强度超声刺激离体小鼠全脑诱发脑细胞内钙升高离体小鼠全脑的实验装置，超声从颅脑底部入射，并用共聚焦显微钙瞬变结果；（b）超声刺激诱发颅脑背侧体细胞的钙瞬变曲线，，绿线为平均值；（c）共聚焦显微镜对颅脑背侧表面细胞的钙成图为超声刺激 2 秒后图像。（Tyler, 2008） 1.2 Calcium increase in the brain cells induced by low frequency aintensity ulrasonic stimulation. （Tyler, 2008）聚焦技术，如凹型辐射面聚焦（如图 1.3）、声学透镜聚等技术，超声波的传播路径和聚焦效果可被精确控制，从较高的空间分辨力和灵活的靶点位置调控能力。超声波频焦的空间分辨力也会越高。

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