NLRP3炎症小体在小鼠疲劳样行为中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-19 13:49

【摘要】：研究背景:当前人们工作竞争激烈,生活节奏加快,不可避免地处于应激状态。持续的应激状态会对人体的正常生理机能造成严重影响,进而导致多种疾病发生发展,其中就包括疲劳~([1])。疲劳以及过劳已经日益成为全球性公共健康问题。长期的疲劳会造成学习记忆能力下降和及工作效率低下,影响人们正常生活,甚至可能引发安全生产问题。特别在高强度的军事冲突或非战争军事行动中,疲劳应激损伤严重影响战士身体健康。因此研究疲劳发生发展过程中的相关机制,并开发有效的抗疲劳药物具有非常重要的科学意义和社会意义。疲劳发生的病理生理机制复杂,目前尚不明确。现有的观点认为,疲劳的发生是神经系统、免疫系统以及内分泌系统等多因素共同参与的结果~([2])。研究表明疲劳发生发展过程中免疫系统异常激活,体内多种炎症因子水平(如白介素-1β,IL-1β等)显著升高,并作用于中枢神经系统,诱导机体产生疲劳样症状~([3])。炎症小体的研究近年来受到了越来越多的关注。NLRP3炎症小体是机体固有免疫的重要组成部分,它可以通过自身的NOD样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors)识别损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)以及病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),进而激活下游的信号转导通路,并诱导机体产生适应性免疫应答~([4])。当被激活时,NOD样受体将募集凋亡相关斑点样蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)和半胱天冬氨酸蛋白酶前体pro-Caspase-1形成多蛋白复合体,即NLRP3炎症小体。活化的NLRP3炎症小体可以切割pro-Caspase-1生成活化的Caspase-1,活化的Caspase-1可以切割IL-1β及IL-18前体并生成有活性的IL-1β及IL-18,并分泌到胞外,发挥致炎作用。炎症小体的适当活化可以抵抗病原体感染和减轻应激损伤,但是当其活化失控时也能造成炎症效应的放大和器官损伤~([5])。目前已有研究发现,慢性疲劳综合症(chronic fatigue syndrome,CFS)患者的血清中IL-1β水平显著升高,而IL-1β是NLRP3炎症小体活化后的重要产物,因此我们推测NLRP3炎症小体可能参与了疲劳的发生发展。但是对于NLRP3炎症小体是否参与疲劳的发生发展,以及涉及的具体机制目前尚无文献报道。因此深入研究NLRP3炎症小体在疲劳发生中的作用及其相关分子机制,对于阐述疲劳的发生机制,以及提出新的疲劳防治策略具有重要意义。研究目的:本研究拟利用急性疲劳和慢性疲劳两种小鼠模型,检测中枢神经系统中NLRP3炎症小体的激活水平;利用Nlrp3基因敲除(Nlrp3~(-/-))小鼠明确NLRP3炎症小体在疲劳发生中的作用;检测活性氧水平,阐明NLRP3炎性小体激活的活性氧机制;最后应用Ω-3不饱和脂肪酸对上述疲劳模型进行干预,验证NLRP3炎症小体和活性氧在改善和治疗疲劳过程中的作用。研究方法:本课题首先探索建立了(1)急性疲劳模型:脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)复合强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型;(2)慢性疲劳模型:反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型。选择小鼠的自发活动距离和转棒仪在棒时间作为其疲劳状态的行为学指标,判定疲劳模型是否成功以及小鼠的疲劳程度。然后以小鼠中枢神经系统作为研究靶器官,检测NLRP3炎症小体在中枢神经系统中的激活水平。再次对Nlrp3~(-/-)小鼠进行相同的疲劳模型建模处理,并检测包括自发活动距离和转棒仪在棒时间在内的行为学指标。同时检测野生型和基因敲除型小鼠脑中活性氧的生成情况,探究NLRP3炎症小体活化的具体机制。最后,选用Ω-3不饱和脂肪酸—DHA对反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳进行干预,进一步验证NLRP3炎症小体作为疲劳治疗靶点的价值。研究结果:1、NLRP3炎症小体参与了LPS复合强迫游泳诱导的小鼠急性疲劳模型1.1成功建立小鼠急性疲劳模型,建立的方法是先在小鼠腹腔注射3 mg/Kg LPS然后进行强迫游泳20min,小鼠出现了明显疲劳样行为,表现为小鼠自发活动距离缩短,转棒仪在棒时间缩短,说明模型建立成功。1.2该疲劳模型小鼠血清IL-1β和IL-6含量的升高,脑中NLRP3和Pro-IL-1β的mRNA和蛋白表达水平升高,免疫荧光结果显示NLRP3炎症小体组装形成并激活。1.3与野生型小鼠相比,Nlrp3~(-/-)小鼠在LPS复合强迫游泳诱导下所表现的疲劳行为显著减轻。Nlrp3~(-/-)小鼠在相同的LPS复合强迫游泳诱导下脑组织中Caspase-1酶的激活显著减少,并伴有IL-1β水平的明显降低。2、NLRP3炎症小体参与了反复强迫游泳诱导的小鼠慢性疲劳模型2.1成功建立小鼠慢性疲劳模型,通过反复强迫游泳,负重每12 h游泳10min,连续持续14天,建立了慢性疲劳模型。反复强迫游泳可以诱导野生型小鼠产生明显的疲劳样行为,表现为小鼠自发活动距离缩短,转棒仪在棒时间缩短,与之相比,Nlrp3~(-/-)小鼠的疲劳样行为明显减轻。2.2反复强迫游泳建立的慢性疲劳模型,野生型小鼠大脑前额叶皮质脑区的NLRP3炎症小体显著组装并活化,IL-1β水平显著升高。和野生型疲劳小鼠相比,Nlrp3~(-/-)小鼠的疲劳样行为显著减轻,并伴有前额叶皮质脑区和血清中IL-1β的水平显著降低。2.3在反复强迫游泳诱导的疲劳下,野生型和Nlrp3~(-/-)小鼠脑中的活性氧水平,血清中丙二醛都显著升高,但在野生型和Nlrp3~(-/-)小鼠之间的差异没有统计学意义。3、Ω-3不饱和脂肪酸在反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型中的作用及其可能机制3.1Ω-3不饱和脂肪酸可以明显改善反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳样行为,小鼠自发活动距离和转帮仪在棒时间显著延长。3.2Ω-3不饱和脂肪酸通过抑制反复强迫游泳诱导的疲劳小鼠前额叶皮质脑区中NLRP3炎症小体的组装激活、IL-1β的升高以及疲劳小鼠脑中活性氧的生成来改善疲劳状态。结论:本课题发现中枢神经系统NLRP3炎症小体激活导致两种不同模型的疲劳发生;NLRP3-IL-1β通路在疲劳发生过程中起重要作用。Ω-3不饱和脂肪酸通过抑制NLRP3炎症小体的激活和活性氧的生成,进而缓解小鼠疲劳样行为。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R363
【图文】：

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疲劳模型导致小鼠自发活动距离缩短，转棒仪在棒时间缩短，表现出了明显的疲劳样行为，表示模型建立成功。因此本研究采用 LPS 复合强迫游泳的方法来建立模型，进行后续试验。2、LPS 复合强迫游泳建立小鼠疲劳模型的炎症因子水平和生化指标除了上述行为学实验外，我们检测了小鼠血清的乳酸、丙二醛（MDA），并同时检测小鼠肌肉中 MDA 的水平，小鼠血清中炎症因子 IL-1β、IL-6 的水平以了解小鼠的体内的炎症状态。结果发现，血清中乳酸、MDA 的水平在 4 个组之间并没有显著性差异（图 2.A、图 2.B，p>0.05），肌肉中 MDA 的水平在 4 个组之间也没有显著性差异（图 2.C，p>0.05）。与空白对照组相比，LPS 复合强迫游泳组小鼠血清中 IL-1β 和 IL-6 的水平显著升高（图 2.D、图 2.E， p<0.01），LPS 组和强迫游泳组的炎症因子水平则没有显著变化（图 2.D、图 2.E，p>0.05）。上述结果表明，LPS 复合强迫游泳组小鼠不仅表现出明显的疲劳样行为，并且伴有血清中 IL-1β 和 IL-6 的水平显著升高，表明该模型伴随有一定程度的体内炎症反应。

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NLRP3 炎症小体在小鼠疲劳样行为中的作用及分子机制LPS 复合强迫游泳后，小鼠产生明显的疲劳样行为。（A）在自发活动实验中，以 10 分钟为间隔监测小鼠自发活动 1 小时。与空白对照组相比，LPS 复合强迫游泳组的自发活动距离显著减少。（B）在转棒仪在棒时间上，相较于空白对照组，LPS 复合强迫游泳组的在棒时间也明显缩短。结果用平均值±标准误表示（mean ±SEM）。* p<0.05，** p <0.01 vs 空白对照组（ANOVA）。（n = 5 ~ 8）。

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强迫游泳诱导的疲劳小鼠脑中 Caspase-1 p10 的蛋白水平也明显升高（图 4C，p<0.01）。上述结果表明，LPS 复合强迫游泳可以使小鼠脑中 NLRP3 蛋白表达明显升高，Caspase-10 并且 NLRP3 炎症小体活化的产物 IL-1β 也显著提高，表明IL-1β 的升高有可能和 NLRP3 炎症小体的激活有关。3、LPS 复合强迫游泳诱导的疲劳小鼠中脑中 NLRP3 炎症小体的组装和激活情况同时为了更加直观地反映 NLRP3 炎症小体的组装状态，本研究应用了免疫荧光染色的方法，将细胞核标记为蓝色，NLRP3 蛋白标记为绿色，IL-1β 标记为红色，当 NLRP3 和 IL-1β 相互聚集时，会合成显色为黄色，表示 NLRP3 炎症小体处在组装状态，表示 NLRP3 炎症小体激活。结果表明 LPS 复合强迫游泳诱导的疲劳小鼠的脑区切片中的黄色区域明显增多，提示 NLRP3 炎症小体处于激活状态（图 4D）。以上结果表明 NLRP3 炎症小体和 LPS 复合强迫游泳诱导的疲劳小鼠导致的疲劳行为密切相关，因此，接下来用 Nlrp3-/-小鼠来验证基因敲除以后，小鼠的疲劳行为是否有改善。

【参考文献】