1-磷酸神经鞘氨醇诱导心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化的实验研究

发布时间：2020-07-19 16:11

【摘要】：冠状动脉疾病已经成为目前威胁人类健康的主要疾病,冠状动脉血管平滑肌不仅在冠状动脉的发生发育中有着重要的作用,还参与了冠状动脉血管结构的组成及功能的发挥。因此,充分了解冠状动脉血管平滑肌细胞的起源对于探索更多更有效的冠状动脉血管疾病治疗方法有着重要的意义。心外膜祖细胞(Epicardial progenitor cells,EpiCs),是一个表达Tbx18、WT1和Tcf21等转录因子的祖细胞池,是心脏发育过程中第一、第二生心区的重要补充,因此也被认为是心脏的第三心生区。心外膜祖细胞在心脏发育及血管的生成中具有不可或缺的作用。目前的研究发现心外膜祖细胞是冠状动脉血管平滑肌细胞的来源之一。同时还发现心外膜祖细胞还可以分化为成纤维细胞、内皮细胞、窦房结细胞等。S1P是一种具有多种生物学功能的脂质,主要通过与五种G蛋白偶联受体结合发挥作用。S1P受体在体内广泛分布,其中以S1P_1、S1P_2、S1P_3三种受体的分布最为广泛,在心血管系统的发生发育中具有重要的作用,还通过多种信号通路调节平滑肌细胞的功能,包括增殖、迁移、分化等功能。既往的研究发现S1P可以诱导脂肪来源的间质细胞及中胚层成血管细胞分化为平滑肌细胞。心外膜祖细胞具有分化为平滑肌细胞的潜能,而S1P可以诱导细胞分化为平滑肌细胞,进而我们推测S1P可能具有诱导心外膜祖细胞分化为平滑肌细胞的功能,明确S1P这一诱导分化作用对寻找新的冠状动脉血管疾病的治疗方法具有一定的临床价值。因此,在本研究中我们探索了S1P诱导心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化的作用,并检测了可能参与这一作用S1P受体。第一部分:心外膜祖细胞的提取及鉴定目的:建立体外E11.5天心外膜祖细胞的培养模型,检测培养心外膜祖细胞上S1P受体的表达情况,为探讨心外膜祖细胞的分化作用做好研究基础。方法:通过获取E11.5天胚胎心室组织进行种植,并从组织边缘爬出心外膜祖细胞的方法建立心外膜祖细胞的体外培养模型。PCR及细胞免疫荧光的方法检测心外膜祖细胞特异性标志物Tbx18及WT1转录因子的表达。通过PCR的方法检测心外膜祖细胞上各S1P受体的表达情况。结果:实验提取的细胞高表达转录因子Tbx18及WT1,低表达cTnT,细胞形态呈“铺路石”样排列生长。提取细胞主要表达S1P_1、S1P_2、S1P_3受体,几乎不表达S1P_4、S1P_5受体。结论:实验所提取的原代细胞为心外膜祖细胞,且细胞纯度高,成功建立了心外膜祖细胞的体外培养模型。明确了S1P受体在心外膜祖细胞的表达,为之后探讨S1P通过其受体发挥的诱导分化作用奠定了研究基础。第二部分:S1P诱导心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化目的:探讨S1P诱导心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化及其机制。方法:建立心外膜祖细胞的体外培养模型,用不同浓度的S1P(0.1uM、0.5uM、1uM、2uM、5uM)处理细胞,通过qRT-PCR方法检测平滑肌细胞标志物α-SMA及MYH11的表达情况,筛选出S1P药物干预的最佳刺激浓度。将培养的心外膜祖细胞进行随机分组,即对照组、S1P组(0.5uM S1P)、S1P+JTE013组(0.5uM S1P+1uM JTE013)、S1P+VPC23019组(0.5uM S1P+1uM VPC23019),通过qRT-PCR及免疫荧光的方法检测平滑肌细胞标志物α-SMA及MYH11的表达情况,探索S1P_1、S1P_2、S1P_3受体抑制后对S1P诱导分化作用的作用。再次将培养细胞随机分组为:对照组、S1P组(0.5uM S1P)、SEW2871组(30uM SEW2871)及S1P+W146组(0.5uM S1P+10uM W146),通过qRT-PCR及免疫荧光的方法检测α-SMA及MYH11的表达情况,探讨S1P_1受体在诱导分化中的作用。制备三维胶原凝胶模型,通过凝胶收缩实验观察不同处理方法干预细胞后胶原的收缩情况。结果:S1P药物干预心外膜祖细胞6天后,当S1P干预浓度为0.5uM时,α-SMA及MYH11的表达量达到峰值,说明0.5uM浓度为S1P干预的最佳刺激浓度。S1P_2受体的抑制剂JTE013和S1P_1/S1P_3受体的抑制剂VPC23019预处理心外膜祖细胞后,qRT-PCR检测发现这两种方式干预细胞后的α-SMA及MYH11表达量较单独S1P处理的表达量明显降低,且VPC23019处理后这两种平滑肌细胞标志物的表达量降低更加明显。细胞免疫荧光也得到了同样结果。S1P_1受体的激动剂SEW2871干预心外膜祖细胞后,mRNA水平α-SMA及MYH11表达量与对照组相比较并没有增加。用S1P_1受体抑制剂W146预处理心外膜祖细胞后,α-SMA及MYH11表达量较S1P组没有明显的差异。免疫荧光也支持上述结果。S1P处理后的细胞制备胶原凝胶,再用卡巴胆碱刺激后可见凝胶明显收缩。S1P+W146组的凝胶也明显收缩,S1P+JTE013组及S1P+VPC23019组凝胶未发生明显的收缩。SEW2871组凝胶未发生收缩。结论:S1P可以诱导心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化,在S1P的诱导分化中S1P_3受体起主要作用,S1P_2受体起次要作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2
【图文】：

祖细胞,心外膜

高倍镜下观察细胞形态更为清楚，细胞融合排列（图1-C）。图 1 心外膜祖细胞的培养。A、B 均为低倍镜下所见视野，C 为高倍镜下所见视野。Figure 1 The culture of epicardial progenitor cells. (A-B) Morphology of EpiCs observed underlow power microscope after 24 h culture (×200); (C) EpiCs under high power microscope(×400).2.2 心外膜祖细胞的鉴定为了鉴定实验所提取的细胞，并明确提取细胞的纯度，实验中采用了 qRT-PCR及细胞免疫荧光两种方法。以原代心肌细胞为对照，图 2 中可见，实验所提取的细胞高表达 Tbx18 和 WT1 两种转录因子，低表达心肌细胞标志物 cTnT。同时细胞免疫荧光的结果可见提取细胞高表达心外膜祖细胞标志物Tbx18和WT1（图3）。用 PBS 作用抗体的阴性对照，以此说明抗体的特异性。综合以上实验结果可以证实实验所提取的细胞为心外膜祖细胞。A BC2 结果

祖细胞,心肌细胞,外膜,心外膜

图 2 Tbx18、WT1 及 cTnT 在心外膜祖细胞及心肌细胞中的表达。e mRNA expression levels of Tbx18、WT1 and cTnT in EpiCs and ca图 3 心外膜祖细胞标志物 Tbx18 和 WT1 的表达（标尺为 500 μm）。e Immunofluorescence staining of Tbx18 and WT1 in EpiCs. (Scale b

祖细胞,心外膜,标志物,标尺

及细胞免疫荧光两种方法。以原代心肌细胞为对照，图 2 中可见，实验所提取的细胞高表达 Tbx18 和 WT1 两种转录因子，低表达心肌细胞标志物 cTnT。同时细胞免疫荧光的结果可见提取细胞高表达心外膜祖细胞标志物Tbx18和WT1（图3）。用 PBS 作用抗体的阴性对照，以此说明抗体的特异性。综合以上实验结果可以证实实验所提取的细胞为心外膜祖细胞。A BC2 结果

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