KLF6及iNOS在铜绿假单胞菌上清液诱导巨噬细胞凋亡过程中的表达及机制的研究

发布时间：2020-07-20 16:50

【摘要】：目的检测铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)上清液诱导小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)凋亡过程中Krupple-like因子6(Krupple-like factor 6,KLF6)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)的表达水平,探讨KLF6及iNOS在此凋亡过程中作用及机制。方法MTT法检测细胞增殖率筛选出适宜的浓度和作用时间,PA上清液根据浓度的不同分为对照组(加入等容积的完全培养基),15%PA组、30%PA组、45%PA组(PA浓度~([1])为PA上清液与完全培养的体积比),分别作用12h、24h。另设SMT(-)组(不加SMT)、SMT(+)组(SMT为iNOS阻断剂,浓度根据说明书和预实验结果选取6μM),根据MTT结果选取30%PA上清液作用细胞24h作为处理条件。流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst 33342染色观察细胞核形态变化,Western blot检测KLF6、iNOS蛋白的表达情况,荧光定量PCR检测KLF6 mRNA、iNOS mRNA的表达水平,NO含量检测试剂盒检测NO含量,用SPSS16.0软件进行数据分析。结果1、MTT结果显示,RAW264.7的增殖率随着PA上清液浓度的增加而增加,随着作用时间的延长而增加,筛选出后续实验的作用时间是12h、24h。同浓度PA上清液作用12h、24h时,细胞增殖率随着作用时间的延长而升高,差异有统计学意义(P0.05)。不同浓度PA上清液处理相同时间时,细胞增殖率随着浓度的增加而升高,差异有统计学意义(P0.05)。说明PA上清液对RAW264.7细胞有增殖抑制作用,且抑制效应呈时间-浓度依赖性。2、流式细胞仪检测结果显示,RAW264.7细胞与不同浓度的PA上清液作用24h后,与对照组相比,RAW264.7的凋亡率随着PA上清液浓度的增加而增加,差异有统计学意义(P0.05)。PA上清液可诱导RAW264.7细胞的凋亡,且呈浓度依赖性。3、经Hoechst 33342染色后,对照组RAW264.7细胞的细胞核呈蓝色圆形或椭圆形,染色体均匀一致;经不同浓度的PA上清液处理RAW264.7细胞24h后,细胞核固缩,深染,核内可见浓染致密的块状颗粒,这些细胞核形态变化均为细胞凋亡的表现。其中以45%PA组上清液处理组最为明显,提示PA上清液诱导RAW264.7细胞凋亡呈浓度依赖性。4、Western blot结果显示,不同浓度的PA上清液分别感染RAW264.7细胞24h后,KLF6、iNOS蛋白表达均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。30%PA组感染RAW264.7细胞12h、24h后,KLF6、iNOS表达水平均明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。5、荧光定量PCR结果显示,不同浓度的PA组处理RAW264.7细胞24h后,细胞中KLF6 mRNA、iNOS mRNA分子表达水平均高于对照组,且呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。30%PA组感染RAW264.7细胞12h、24h后,细胞中KLF6 mRNA、iNOS mRNA分子表达水平均高于对照组,且呈时间依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。6、NO含量检测结果示,不同浓度的PA组感染RAW264.7细胞24h后,细胞上清液中的NO含量随着PA上清液浓度的增加而增加,差异有统计学意义(P0.05)。30%PA组感染RAW264.7细胞12h、24h后,细胞上清液中的NO含量随着PA上清液作用时间的延长而增加,差异有统计学意义(P0.01)。7、SMT(+)组的细胞,经30%PA上清液处理24h后,与SMT(-)组相比,RAW264.7细胞中iNOS蛋白表达水平有所降低(P0.01),差异有统计学意义。同时检测细胞上清液中的NO含量,与SMT(-)组相比,NO含量有所下降,差异有统计学意义(P0.05)。SMT阻断iNOS生成后,流式细胞仪检测PA上清液感染的RAW264.7细胞的凋亡率,与SMT(-)组相比,细胞凋亡率明显下降,差异有统计学意义(P0.01)。结论1、PA上清液能抑制RAW264.7细胞增殖,且其抑制效应呈浓度-时间依赖关系。2、PA上清液诱导RAW264.7细胞凋亡的机制可能是KLF6调控iNOS产生过量的NO诱导细胞凋亡。3、iNOS表达的减少对于PA上清液感染RAW264.7细胞引起的细胞毒性起到一定的保护作用。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392
【图文】：

上清液,对照组,浓度

：与同浓度PA上清液6h组相比，&P<0.05；与同浓度PA上清液12h组相比，○P<0.PA上清液24h组相比，●P<0.05 7-2 不同浓度 PA 上清液对 RAW264.7 细胞增殖率的影响（ x ±s，n=组别 6h 12h 24h 48h对照组 0 0 0 0%PA组 3.17±1.89 12.97±0.63**32.19±3.23**44.88±7% PA组 3.6±0.53*27.47±2.13**#48.14±3.85**#58±4.5% PA组 7.02±0.6*▲49.17±3.92**#▲63.79±3.73**#▲79.73±6.F值 21.251 175.212 152.058 76.10P值 0.000 0.000 0.000 0.00：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与15%PA组相比，#P<0.05；与30%PA组相05；

凋亡,上清液

0 103104105105105110410411031031031030000010-310-310-310-30% PA supernatant45% PA supernPIPIPInexinAVPI

上清液,细胞,多功能,细胞核

PA 上清液作用 RAW264.7 细胞后的形态学变化 Hoechst 33342 染色后，对照组 RAW264.7 细胞的细胞核呈蓝色圆形染色体均匀一致；经浓度为（15%、30%、45%）的 PA 上清液处理 RAW24h 后，细胞核固缩，深染，核内可见浓染致密的块状颗粒，这些细胞均为细胞凋亡的表现，其中以 45% PA 组处理组最为明显，见图 3。

【参考文献】