基于氨基酸代谢的原位生物正交标记动态示踪肠道病毒EV71侵染的研究

发布时间：2020-07-21 18:14

【摘要】：肠道病毒EV71(Enterovirus 71,EV71)作为引发手足口病(Hand Foot Mouth Disease,HFMD)的主要病原体,可导致脑炎、脑膜炎、急性弛缓性麻痹、心肺功能衰竭甚至死亡。然而,目前对肠道病毒EV71感染机制仍不够清晰,国家和社会对相关疾病的防控依然面临巨大挑战。示踪病毒感染途径是研究病毒感染机制不可或缺的手段,而病毒的成功标记是实现病毒示踪的关键。常规的基因工程、直接化学偶联或病毒自组装等方法存在操作繁杂,标记效率低,普适性差和影响病毒活性等缺陷,难以推广应用。近年来,基于代谢工程的生物正交标记技术由于具有高效、特异、无损、稳定的优势,正日益成为标记活体生物系统的重要手段。该策略通过天然代谢途径在靶标物中引入特定的化学报告基团,然后通过生物正交反应与携带配对基团的标记物进行共价连接,从而实现对靶标物的特异标记。鉴于病毒衣壳蛋白合成依赖于宿主细胞,因此利用细胞氨基酸代谢可有效实现病毒衣壳修饰。为实现肠道病毒EV71高效无损的标记与示踪,本研究提出一种新型的基于氨基酸代谢的病毒原位生物正交标记技术,并利用该技术对肠道病毒EV71侵染机制进行深入探究。1.基于氨基酸代谢修饰的肠道病毒EV71生物正交标记技术的建立。利用宿主细胞氨基酸代谢将甲硫氨酸叠氮衍生物(L-Azidohomoalanine,Aha)嵌入子代病毒衣壳蛋白中,成功制备叠氮修饰的肠道病毒EV71(N3-EV71)。N3-EV71通过生物正交反应与携带二苯基环辛炔(DBCO)的荧光探针形成稳定连接,从而成功实现病毒的原位标记。结果表明,DBCO-探针能够高效、特异地捕获N3-EV71病毒粒子实现病毒标记,并且叠氮基团的代谢修饰和荧光探针的原位标记能有效保护病毒侵染活性,为后续病毒的动态示踪提供了可靠的技术手段。2.生物正交标记动态示踪研究肠道病毒EV71的侵染机制。我们运用SYTO染料与原位生物正交技术分别对病毒核酸与衣壳进行无损标记,实现病毒双重标记与动态示踪。结果显示,肠道病毒EV71与细胞表面清道夫受体结合后经网格蛋白介导的内吞入胞,并在晚期内涵体酸性环境中完成病毒核酸的快速释放,阐明了EV71病毒的侵染过程与脱衣壳机制。本研究提出并建立了一种新型的基于氨基酸代谢的原位生物正交标记技术,并利用该技术对肠道病毒EV71进行无损标记与动态示踪,成功阐明其侵染机制,为相关抗病毒药物的研制提供新的理论依据。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373.25
【图文】：

肠道病毒,肠道病毒感染

第 1 章引言足口病和肠道病毒 EV71足口病（HandFootMouthDisease,HFMD）于 1957 年首次在新西兰发现亚太地区流行[1,2]（如图 1.1）[3]。HFMD 是一种常见于 5 岁以下幼儿的，通常被感染患者表现出恶心、呕吐、低热、厌食和手、足、口等部位或溃疡等临床症状[4]。HFMD 由肠道病毒感染引起，其中柯萨奇病毒 Asackievirus A16，CA16）和肠道病毒 EV71（Enterovirus 71, EV71）是主病原体，而且由肠道病毒 EV71 感染引起的 HFMD 可能发展为脑炎、急性弛缓性麻痹和心肺功能衰竭甚至死亡[5]。由于目前对肠道病毒 EV制缺乏深入研究，国家和社会对相关疾病的防控依然面临巨大挑战。

肠道病毒,基因组

图 1.2 肠道病毒 EV71 结构与基因组示踪的研究进展宿主细胞是一个连续动态的复杂过程，主要包括：识装和子代病毒释放等过程。而常规的对病毒侵染机制连续观察。近年来，随着光学成像技术的发展，病毒病毒感染机制的有效方法[9]，病毒感染机制的研究对染疾病具有重大意义。目前可用于病毒标记示踪的方直接化学偶联或物理嵌合法，以及病毒自组装法。程标记技术标记法不仅应用于病毒粒子的标记，还常见于动植物记[10]。病毒基因工程标记法指将报告基因（荧光蛋白

基因工程,荧光蛋白

在激光共聚焦扫描显微镜下观察 HSV-1 组织趋作用。程标记技术在理论上被认为是最高效的病毒标记方法不仅技术要求高而且操作过程繁杂甚至会导于很大一部分荧光蛋白的错误折叠、发色团不成熟的荧光强度下降，这种情况在小尺寸病毒粒子中，体积较大的荧光蛋白（~27 kDa）往往会降低免上述蛋白基因融合所带来的问题，部分研究者半胱氨酸短肽标签（TC-tag）修饰蛋白而后利用分研究者使用 20kDa 的 SNAP-tag 标签（人的氧型体），其可通过与苄基鸟嘌呤衍生物共价连接技术发展不成熟，尚未普遍用于病毒示踪标记研标记[20]。

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