胞外ADP作用人成熟精子的机制研究
发布时间：2020-07-22 15:15
【摘要】：人成熟精子进入女性生殖道后,需要经历一系列生理生化过程,包括获能、超活化运动、趋化运动和顶体反应等,最终才能和卵细胞结合形成受精卵。其中,雌性生殖道内的生理因子是调节上述生理生化过程的重要因素。有研究表明,胞外ATP(ATPe)对人成熟精子的运动、超活化运动和顶体反应均有显著影响。ADP是一种ATP的天然代谢物,胞外ADP(ADPe)是否影响人精子的生理功能以及相关的机制目前都尚未探究。钙离子在精子功能调节中发挥重要作用的第二信使。利用多功能酶标仪检测胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i),本课题首先考察了ADPe对人精子[Ca~(2+)]_i的影响。结果表明,ADPe(50,100,200,500,1000,2500μM)浓度依赖性的增加人精子[Ca~(2+)]_i,并在1000μM处达到饱和。利用Ca~(2+)螯合剂BAPTA使精子处在无钙环境中,ADPe不能引起[Ca~(2+)]_i增加,表明ADPe引起的[Ca~(2+)]_i增加是由外Ca~(2+)内流导致。由于P2Y受体是与ADPe结合的膜受体,本课题通过western-blot检测发现人成熟精子中P2Y(1,2,13,14)受体表达,而广谱型P2Y受体抑制剂suramin和PPADs显著抑制ADPe诱导的精子[Ca~(2+)]_i增加。进一步考察P2Y(1,2,13,14)抗体对ADPe所诱导的人精子[Ca~(2+)]_i增加的影响,结果显示只有P2Y13抗体体现出显著的抑制作用,提示P2Y13受体介导了ADPe导致的人精子[Ca~(2+)]_i增加。P2Y13受体作为一种G蛋白偶联受体,并不能直接介导Ca~(2+)内流。基于CatSper是目前已知的唯一公认的精子特异性钙离子通道,本课题进一步研究ADPe所导致的人精子[Ca~(2+)]_i增加是否由CatSper介导。膜片钳检测结果表明,ADPe显著的增加CatSper电流,而P2Y受体的抑制剂PPADs和suramin、以及P2Y13抗体均能显著的抑制ADPe导致的CatSper电流增加。此结果表明:ADPe与P2Y13结合后通过激活CatSper通道而导致了人精子[Ca~(2+)]_i升高。然而,其中P2Y13活化后如何激活CatSper的信号机制仍有待进一步研究。本课题还考察了ADPe对人成熟精子功能的影响,发现上述浓度的ADPe能促进人成熟精子的超活化运动,表明ADPe导致[Ca~(2+)]_i增加具有显著的生理效应,也与CatSper是调控精子超活化运动的主要分子的观点一致。综上所述,ADPe通过激活人成熟精子细胞膜表面的P2Y13受体,继而激活CatSper通道,使[Ca~(2+)]_i显著增加。与此同时,ADPe促进人成熟精子超活化。本课题对深入认识生理条件下胞外ATP/ADP在受精过程中的作用与机制具有重要意义。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R321.1
【图文】：
哺乳动物成熟精子具有一个高度浓缩的细胞核，因此不具备转录和翻译功能[2]。因此成熟精子的生理功能完全依赖于转录翻译后蛋白修饰。基于 Ca2+信号在蛋白翻译后的核心调控作用，因此其对成熟精子功能调节尤为重要。大量研究已表明 Ca2+几乎参与精子受精整个生理过程中。如精子获能，超活化运动，趋化反应，顶体反应等生理过程。雌性生殖道内的生理因子，如孕酮、睾酮、cAMP、白蛋白等[16, 18-22]，也主要通过调节[Ca2+]i浓度来快速调节精子的生理功能。成熟精子[Ca2+]i主要来源于细胞膜上离子通道介导的外钙内流[23]。目前精子上发现的几种主要介导胞外 Ca2+内流的通道包括经典的电压门控钙离子通道（Ca2+v） TRP 通道，CNG 通道和精子特异性的 CatSper 通道（CatSper 通道也具有电压依赖性）。已有研究表明小鼠[Ca2+]i调控主要依赖于 Cav2,TRPC2 和CNGA3 通道。随着研究不断深入，大量数据表明 CatSper 通道对精子[Ca2+]i调控扮演着密不可分的角色。CatSper1-4 缺失的小鼠是不育的[24-27]。临床数据也表明 CatSper1，2 缺失的男性存在不育的情况[28-29]。
]i又逐渐恢复至静息水平附近（图3.1A）。100 μM ADP 显著的引起[Ca2+]i 增加，且 1000 μM ADP 引起精子[Ca2+]i 增加达到最大值。统计数据分析显示 ADPe 增加[Ca2+]i 的最高幅度为 45.9%（图 3.1 B）。通过制作浓度依赖曲线，发现 ADPe 诱导人精子[Ca2+]i 的半最大激活浓度为为562 μM (EC50=562 μM)（图 3.1 C）图 3.1ADP 浓度依赖性的增加人精子[Ca2+]iFig 3.1 ADPe dose-dependently increases human sperm [Ca2+]i
浓度增加幅度的统计结果，n=5；（C）ADPe 诱导[Ca2+]i的浓度依赖曲线，EC50=562 μM(A) The time-course curves showed the changes of human sperm [Ca2+]iinduced by AD(50-2500 μM); (B) Statistical analysis the amplitude changes of [Ca2+]ievoked by ADPe, n=5; Dose-response curve of ADPe induced [Ca2+]i, EC50=562 μM.3.1.2 ADPe 增加的[Ca2+]i来源于胞外 Ca2+内流人精子胞内 Ca2+主要来源于胞内高尔基体和内质网的 Ca2+库释放和胞Ca2+内流。为进一步分析 ADPe 诱导的人精子[Ca2+]i来源，我们利用 Ca2+螯合BAPTA 使精子处于无 Ca2+环境中，来观察 ADP 对[Ca2+]i浓度的影响。实验结表明当精子悬液与含有 12 mM BAPTA 溶液按照 1：1 比例混合，精子[Ca2+]i于静息水平。该效应可能是由于 BAPTA 螯合精子胞外溶液中的 Ca2+使精子胞Ca2+浓度处于极低的水平，精子为适应胞外环境的变化，而使得胞内 Ca2+排出致。当精子悬液与 12 mM BAPTA 和 2000 μM ADPe 的无外钙溶液 1：1 混合结果显示 ADPe 不能增加[Ca2+]i（图 3.2）。结果表明 ADPe 诱导的人精子[Ca2来源于是外 Ca2+内流。
本文编号：2765995
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R321.1
【图文】：
哺乳动物成熟精子具有一个高度浓缩的细胞核，因此不具备转录和翻译功能[2]。因此成熟精子的生理功能完全依赖于转录翻译后蛋白修饰。基于 Ca2+信号在蛋白翻译后的核心调控作用，因此其对成熟精子功能调节尤为重要。大量研究已表明 Ca2+几乎参与精子受精整个生理过程中。如精子获能，超活化运动，趋化反应，顶体反应等生理过程。雌性生殖道内的生理因子，如孕酮、睾酮、cAMP、白蛋白等[16, 18-22]，也主要通过调节[Ca2+]i浓度来快速调节精子的生理功能。成熟精子[Ca2+]i主要来源于细胞膜上离子通道介导的外钙内流[23]。目前精子上发现的几种主要介导胞外 Ca2+内流的通道包括经典的电压门控钙离子通道（Ca2+v） TRP 通道，CNG 通道和精子特异性的 CatSper 通道（CatSper 通道也具有电压依赖性）。已有研究表明小鼠[Ca2+]i调控主要依赖于 Cav2,TRPC2 和CNGA3 通道。随着研究不断深入，大量数据表明 CatSper 通道对精子[Ca2+]i调控扮演着密不可分的角色。CatSper1-4 缺失的小鼠是不育的[24-27]。临床数据也表明 CatSper1，2 缺失的男性存在不育的情况[28-29]。
]i又逐渐恢复至静息水平附近（图3.1A）。100 μM ADP 显著的引起[Ca2+]i 增加，且 1000 μM ADP 引起精子[Ca2+]i 增加达到最大值。统计数据分析显示 ADPe 增加[Ca2+]i 的最高幅度为 45.9%（图 3.1 B）。通过制作浓度依赖曲线，发现 ADPe 诱导人精子[Ca2+]i 的半最大激活浓度为为562 μM (EC50=562 μM)（图 3.1 C）图 3.1ADP 浓度依赖性的增加人精子[Ca2+]iFig 3.1 ADPe dose-dependently increases human sperm [Ca2+]i
浓度增加幅度的统计结果，n=5；（C）ADPe 诱导[Ca2+]i的浓度依赖曲线，EC50=562 μM(A) The time-course curves showed the changes of human sperm [Ca2+]iinduced by AD(50-2500 μM); (B) Statistical analysis the amplitude changes of [Ca2+]ievoked by ADPe, n=5; Dose-response curve of ADPe induced [Ca2+]i, EC50=562 μM.3.1.2 ADPe 增加的[Ca2+]i来源于胞外 Ca2+内流人精子胞内 Ca2+主要来源于胞内高尔基体和内质网的 Ca2+库释放和胞Ca2+内流。为进一步分析 ADPe 诱导的人精子[Ca2+]i来源，我们利用 Ca2+螯合BAPTA 使精子处于无 Ca2+环境中，来观察 ADP 对[Ca2+]i浓度的影响。实验结表明当精子悬液与含有 12 mM BAPTA 溶液按照 1：1 比例混合，精子[Ca2+]i于静息水平。该效应可能是由于 BAPTA 螯合精子胞外溶液中的 Ca2+使精子胞Ca2+浓度处于极低的水平，精子为适应胞外环境的变化，而使得胞内 Ca2+排出致。当精子悬液与 12 mM BAPTA 和 2000 μM ADPe 的无外钙溶液 1：1 混合结果显示 ADPe 不能增加[Ca2+]i（图 3.2）。结果表明 ADPe 诱导的人精子[Ca2来源于是外 Ca2+内流。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 王莎丽;精子的趋温性及其意义[J];基础医学与临床;2004年01期
本文编号：2765995
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/jichuyixue/2765995.html
