神经胶质细胞外粒体的释放途径及膜来源探究

发布时间：2020-07-22 23:23

【摘要】：细胞质膜的内、外侧磷脂组成是不对称的,磷脂酰丝氨酸几乎只存在于质膜内侧。刚好相反,细胞内的内质网、高尔基复合体和囊泡等细胞内膜系统的磷脂酰丝氨酸几乎只存在于膜外侧。生长因子和激素等成分由于原分子具有信号肽,因此在完成合成和去掉信号肽后停留于细胞内膜如囊泡等的囊腔中。外粒体(ectosomes)通常被认为是包含着一小部分质膜和细胞质从细胞质膜芽生释放出去的胞外囊泡。有些外粒体的膜外侧含有较高的磷脂酰丝氨酸并且其囊腔中含有生长因子等成分,这些特征与细胞内的囊泡相一致。为什么质膜衍生物具有与胞内囊泡相一致的组成与特征至今原因未明。我们利用原代培养胶质细胞和细胞骨架解聚药物,通过激光共聚焦的活细胞动态观察等技术研究了外粒体的实时释放过程。我们发现,在神经胶质细胞中至少有三种不同的外粒体释放形式:第一种是经典的质膜芽生形式,其释放过程较为缓慢,囊泡刚形成时较大,然后逐渐缩小至原来直径的三分之一;第二种是囊泡在细胞表面的同一位点连续弹射出去,其释放过程很快;第三种是大量的囊泡在一个细胞的整个表面几乎同一时间由小到大释放出去,囊泡表面积的总和估计比质膜还要大。我们猜测后面两种外粒体的形成似乎是细胞内膜在细胞质膜上由内往外挤出去的。这类外粒体其外被有着与质膜衍生的外粒体完全不同的膜内外侧磷脂组成,并且其腔内含有与胞内囊泡相同的生长因子等成分。我们的ER-tracker标记细胞实验进一步表明,细胞内膜确实能突破质膜直接释放至细胞外。因此,我们认为外粒体可分为两大类:一类是由质膜衍生而来,磷脂酰丝氨酸几乎位于膜内侧,包含物为细胞质;另一类由细胞内膜衍生而来,磷脂酰丝氨酸几乎位于膜外侧,包含物与内膜囊腔成分一致,如生长因子等。本研究发现了外粒体释放的新的途径,合理地解释了外粒体的外被特征和内含物与从质膜芽生不一致的原因。
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：

动态图像,秋水仙素,质膜,胶质细胞

图 1 在 20 μM 秋水仙素刺激下神经胶质细胞质膜产生囊泡结构原代神经胶质细胞在 4 孔 chamber 培养一周后，在共聚焦成像前使用活细胞 Ca2+染料 fluo-4（绿色）在37 ℃细胞培养箱避光进行染色 30 分钟。Time series 程序设置成一秒扫描一帧图像。在 Time series 程序开始扫描 30 秒后，等体积添加秋水仙碱溶液使其终浓度达到 20 μM。图中的数字表示动态图像中扫描的张数和秒数。箭头显示囊泡状结构在质膜出芽，同时胞质内维持高浓度游离态 Ca2+。3.1.2 在 30 μM 秋水仙碱溶液的处理下，观察神经胶质细胞外粒体的释放为了观察细胞外粒体分泌时的释放过程，我们增加了秋水仙碱的浓度。在活细胞成像前，培养在Chamber中的原代培养神经胶质细胞用活细胞Ca2+染料Fluo-4，Ca2+染料 X-Rhod-1 和内质网染料 ERtracker 避光染色 30 分钟。在 Timeseries程序开始扫描至 30 秒时，在培养原代神经胶质细胞的 Chamber 中加入与培养基等体积的秋水仙碱溶液使其终浓度达到 30 μM。在秋水仙碱大约作用 30 秒时，

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神经胶质细胞外粒体的释放途径及膜来源探究过程。首先在细胞边缘形成大量具有很强 Ca2+信号的囊泡结构出现，这种结构在开始时顶出形态较大，然后逐渐拉伸并且与质膜的连接部分逐渐减小，囊泡结构直径也慢慢缩小为刚形成阶段的三分之一（图 3，箭头所示），最后从质膜夹断脱落，完成释放过程。外粒体产生过程中始终维持较强 Ca2+信号。外粒体体积缩小过程大约消耗 60 秒（图 3，58s-120s），外粒体从质膜脱落大约需要 80 秒（图3，120 s-200 s），从外粒体的形成到最后的释放过程大约总体耗时 3 分钟左右。一般认为外界的一定刺激导致细胞胞质内流入大量游离的 Ca2+，触发细胞骨架松动，从而引起外粒体释放。我们的结果似乎表明秋水仙碱刺激引起微管解聚也会导致钙内流触发外粒体的产生与释放。我们认为 30μM 的秋水仙碱达到了刺激神经胶质细胞外粒体释放所需的必要条件，耗时3分钟完成了外粒体的形成和释放。整个过程与其他细胞类型中描述的外粒体在质膜形成出芽的过程相近。

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外粒体从质膜脱落大约需要 80 秒（图3，120 s-200 s），从外粒体的形成到最后的释放过程大约总体耗时 3 分钟左右。一般认为外界的一定刺激导致细胞胞质内流入大量游离的 Ca2+，触发细胞骨架松动，从而引起外粒体释放。我们的结果似乎表明秋水仙碱刺激引起微管解聚也会导致钙内流触发外粒体的产生与释放。我们认为 30μM 的秋水仙碱达到了刺激神经胶质细胞外粒体释放所需的必要条件，耗时3分钟完成了外粒体的形成和释放。整个过程与其他细胞类型中描述的外粒体在质膜形成出芽的过程相近。图 2 在 30 μM 秋水仙碱溶液的下神经胶质细胞产生并释放外粒体在活细胞成像前，chamber 中培养的原代神经胶质细胞用活细胞 Ca2+荧光染料 Fluo-4（绿色），Ca2+荧光染料X-Rhod-1（红色）和内质网 ER tracker（蓝色）在 37 ℃细胞培养箱避光染色 30 分钟。Time series 程序设置40 μm

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