小檗碱对减压病大鼠肺血管内皮细胞损伤的预防效果和机制分析

发布时间：2020-07-23 15:23

【摘要】：研究背景:减压病(decompression sickness,DCS)是由于机体从高压状态向低压梯度减压,体内溶解的气体游离为气相,以气泡形式在血管和组织内聚集,引起机体皮肤痒疹、循环呼吸功能异常、神经系统功能障碍等一系列的症状。DCS是潜水职业中最常见的职业病,在以应急为特点的潜艇脱险与水下救援等军事潜水作业中尤为突出。因此,研究早期预防DCS的有效药物和手段,不仅是潜水医学研究的热点问题,对我国军事潜水人员作战能力的保障和发展更是有着特殊意义。从循环系统的生理结构和减压过程体内气泡产生的规律可知,肺血管内皮细胞是减压气泡损伤的首要靶点,这在既往实验中得到证实。可以推测,通过血管内皮保护能够达到降低减压过程对机体的损伤,从而获得对DCS的预防作用。但已有的研究结果并未明确具体的损伤路径和机制,同时针对内皮细胞保护的单一靶点药物研究未实现综合防治减压损伤的效果。我们认为DCS的损伤机制十分复杂,单一靶点的药理效果不足以缓解减压应激所导致的内皮损伤。我们预期中医药(traditional Chinese medicine,TCM)的多靶点作用可能能提供相对更系统有效的解决方案。通过前期预实验的筛选,我们发现,小檗碱(berberine,BBR)的药理特性与减压导致的内皮损伤机制之间具有高度的对抗性。本研究关注:一是探讨BBR预处理对DCS早期损伤的预防作用及剂量-效应关系;二是分析减压损伤对大鼠肺血管内皮细胞凋亡的影响,探讨BBR对DCS致肺血管内皮细胞损伤与凋亡的保护作用及可能机制;三是分析减压损伤对大鼠肺血管分泌血管舒缩因子的影响,探讨其在减压损伤中的作用,以及BBR预处理通过调节丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)-一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)-一氧化氮(nitric oxide,NO)通路保护内皮细胞功能的机制。以期通过本实验设计及其实施,能够对减压病的早期预防提供有效的干预数据以及对相应信号机制及作用靶点的效用提供实验证据。研究技术方法:1.本研究以大鼠为研究对象,采用空气介质60msw压力暴露60min后30s匀速减至常压制备减压损伤动物模型。预处理药物给药方法:对照组、模型组连续3天每日腹腔注射生理盐水2ml。药物使用组分为两种使用时间,即三天药物预处理和三小时药物预处理。低剂量组、中剂量组、高剂量组,连续2天每日腹腔注射生理盐水2ml,第3日高气压暴露前3h(10:00)腹腔分别以12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg腹腔注射BBR溶液;长时间药物组连续3天以50mg/kg腹腔注射BBR溶液。减压损伤和BBR预处理的干预效果评价指标为预实验经过检验的指标值:大体观察发病时间、死亡时间和死亡率;肺组织病理、肺湿干比分析大鼠肺组织损伤状况;全血自动分析仪检测血细胞计数、血小板活性;ELISA测定肺损伤指标外周血锁链素(desmosine,DES)和肺组织IL-1β。2.在大鼠减压损伤模型的基础上,评估减压损伤对大鼠肺血管内皮凋亡的影响、NF-?B对肺血管内皮细胞凋亡的作用,BBR预处理的干预效果以及通过调节NF-?B表达调控肺血管内皮细胞凋亡的机制。采用ELISA检测肺血管内皮凋亡指标细胞凋亡相关基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱天冬蛋白酶3(Caspase-3)、核因子?B(nuclear factorκB,NF-?B)。采用Real-Time PCR检测肺血管细胞中的BAXmRNA、Bcl-2mRNA、Caspase-3mRNA的转录水平。3.在大鼠减压损伤模型的基础上,评估MAPK-NOS-NO通路在减压损伤致大鼠肺血管舒缩状态改变的信号机制以及BBR预处理对该通路的调节作用。采用硝酸还原法检测NO;采用免疫组化方法测定各组别肺组织eNOS、iNOS、nNOS分布,采用Western blot分析方法测定eNOS、iNOS、nNOS蛋白表达,以及信号调控相关激酶ERK、JNK、p38的磷酸化水平。数据统计分析采用SPSS20.0进行。计量数据采用均值±标准差(x±SD)进行描述;不同处理组采用?~2检验、独立样本t检验和ANOVA分析;指标之间的相互关系采用皮尔逊相关;指标之间的依存关系采用回归曲线拟合。p0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.模型制备结果显示,动物出舱后迅速出现DCS显著特征,死亡率50%。与对照组比较,病理切片显示明显的肺组织水肿、充血,肺湿干比显著升高(p0.05),血液DES显著升高(p0.01),肺组织IL-1β含量显著增高(p0.01);外周血WBC、RBC、NEUT显著增加(p0.01),而PLT显著下降(p0.01);TC、LDL-C显著升高(p0.01)。2.BBR干预结果显示,干预组死亡率有所下降,高剂量组与长时间用药组40%,其余组30%。药物干预组起病时间比模型组显著推迟(?~2=12.30,p0.05)。病理切片显示BBR对肺间质白细胞浸润和水肿有一定的减轻作用,对比各组干预结果,低剂量组减轻肺间质水肿程度较高剂量组更明确,提示低剂量BBR的使用可能更有利于减轻极限减压导致的肺损伤。与模型组相比,各干预组外周血WBC、RBC、NEUT显著降低(p0.01 or p0.05),但仍高于对照组(p0.01 or p0.05);PLT显著升高(p0.01),但仍低于对照组(p0.01)。肺湿干比低剂量、中剂量组与模型组无差异且均显著高于对照组(p0.01),高剂量组与长时间用药组与模型组、对照组相比均无显著性差异。低剂量组、高剂量组DES与模型组相比显著下降(p0.01),结果和对照组相比无显著性差异;干预组肺组织IL-1β较模型组均显著下降(p0.01)。汇总多项评价结果提示,不同剂量3h预处理的BBR对于降低机体减压损伤均有着一定的效果,其中以低剂量组效果相对更优。长时间用药与3h用药在效果上未体现出显著差别。3.肺血管组织凋亡相关蛋白结果显示,模型组Bcl-2蛋白表达比对照组显著降低(p0.01),Bax显著升高(p0.01),Bcl-2/Bax显著下降(p0.01),Caspase-3显著升高(p0.01)。低剂量BBR干预可使肺血管组织Bcl-2回升(p0.01)、Bax回落(p0.01)、Bcl-2/Bax显著上升(p0.01)、Caspase-3显著下降(p0.05)。中剂量和高剂量组与模型组比较能显著提升Bcl-2蛋白表达(p0.05),但对Bax、Bcl-2/Bax、Caspase-3的作用无显著性意义,三天用药组与当天用药组相比显著降低Bcl-2(p0.01)、提升Caspase-3(p0.01)。4.肺血管组织NF-?B结果显示,减压损伤显著降低NF-?B的蛋白表达(p0.01)。低剂量和高剂量组BBR干预后,与模型组比较NF-?B有显著回升(p0.05),与对照组无显著区别。长时间用药组与对照组相比NF-?B显著下降(p0.01),与模型组无显著性差异。Bcl-2/Bax和Caspase-3的变化与NF-?B有显著的线性关系(R~2_(Bcl-2/Bax)=0.556,F=43.742,p0.01;R~2_(Caspase-3)=0.486,F=33.148,p0.01)。5.肺血管组织中凋亡相关基因表达结果显示,减压损伤后Bax mRNA的转录水平显著上调(P0.05),而Bcl-2、Caspase-3mRNA无显著差异。BBR干预结果显示,低剂量组较模型组Bax mRNA转录水平下调(p0.01),但其他干预组与模型组无显著差异。Bax mRNA随着剂量的增加,转录活性有增加趋势。长时间药物组和高剂量组无显著差异。6.外周血血管活性因子结果显示,模型组NO显著降低(p0.01)。BBR干预后,NO有回升的趋势,低剂量组、中剂量组、长时间用药组NO显著升高(p0.05);长时间用药组NO显著高于高剂量组(p0.01)。外周血NO含量与用药剂量呈正相关(r=0.773,p0.01)。7.肺组织NOS定量检测的结果显示,模型组肺组织NOS蛋白含量显著下降(p0.05);免疫组化观察发现,eNOS主要分布在血管内皮和肺泡上皮,并且存在基础性表达,模型组eNOS表达降低;三种亚型WB结果显示,模型组三种亚型均有下降趋势,但差异未达到显著性水平。BBR干预后,与模型组相比,中剂量组、长时间用药组NOS显著升高(p0.01 or p0.05),各干预组肺组织NOS蛋白含量均与对照组无显著差异。三种亚型免疫组化结果显示,BBR干预组血管内皮和肺泡上皮的eNOS分布明显增加;三种亚型WB结果显示,长时间用药组eNOS蛋白表达均较模型组显著增加(p0.01),且显著高于对照组(p0.05)。iNOS的变化与eNOS类似,但未达到显著性水平。肺组织NOS的表达对外周血NO的回归曲线具有较好的预测性(R~2=0.325,F=16.881,p0.01),并且与用药剂量呈相关(r=0.730,p0.01)。8.肺组织MAPK磷酸化水平结果显示,模型组JNK、p38的磷酸化水平显著降低(p0.01),ERK的磷酸化水平无显著差异。BBR干预组p-JNK水平均显著高于模型组(p0.01),且与剂量存在相关性(r=0.865,p0.01)。长时间用药组p-JNK显著高于高剂量组(p0.01)。BBR干预后p-p38的变化与p-JNK类似存在显著差异变化(与模型组相比p0.05)。肺组织p-JNK、p-p38与NOS存在显著预测性(R~2_(JNK)=0.609,F=29.550,p0.01;R~2_(p38)=0.552,F=23.395,p0.01),并且与用药剂量呈正相关(r_(JNK)=0.865,p0.01;r_(p38)=0.856,p0.01)。研究结果提示:病理、肺湿干重比、DES、IL-1β结果提示减压损伤通过血管内气泡在肺的累积,导致肺组织水肿、充血、组织结构破坏和炎症反应。肺血管组织凋亡相关指标结果提示,减压损伤可导致肺血管内皮细胞形态和功能损伤,甚至诱导凋亡。外周血NO结果提示减压损伤可引起血管舒缩功能的变化。NO异常与肺组织NOS含量相关,NOS蛋白表达与MAPK磷酸化水平存在线性关系,提示MAPK-NOS-NO途径在肺组织的减压损伤中发挥作用。研究结果证实了肺血管内皮是减压损伤的重要靶器官,血管内减压性气泡通过损伤肺组织血管内皮细胞,导致血管舒缩因子合成和分泌异常,诱发一系列继发反应。各项结果均提示BBR能有效降低减压损伤。BBR的效应主要体现在:(1)上调MAPK的JNK、p38不包括ERK的磷酸化水平,进而上调eNOS转录水平,增加eNOS在肺血管内皮的蛋白表达,提高NO的合成和分泌,后者可通过舒张血管和抑制血小板集聚、白细胞活化等损伤性炎症反应到达降低减压损伤的最终目标;(2)增加减压后肺组织血管组织的NF-?B的蛋白表达,进而下调其凋亡相关基因Bax的基因表达,抑制血管内气泡诱导的肺血管内皮细胞凋亡,从而保护血管内皮功能,达到对抗减压损伤的作用。BBR的作用对MAPK-NOS-NO存在一定的剂量依赖性,剂量越大JNK、p38的磷酸化水平越高,NOS表达越高,NO合成增加。从大鼠的损伤指标来看,适度增加的NO浓度有利于肺血管维持合理的舒缩功能,但大剂量BBR一方面可能导致血管的过度扩张,另一方面对肺血管内皮细胞从抑凋亡转向促凋亡作用,大体观察和减压损伤的其他指标也提示,虽然高剂量BBR的综合预防效果能起到一定作用,但整体逊于中低剂量,因此,要使BBR能够产生更优抗减压损伤作用,真正实现其预防意义,应在不同减压应激、不同作用环境等条件下作进一步探索研究,以在多种靶点作用之间寻求平衡。本课题研究结果不仅进一步丰富了对减压病机体损伤机制的认识,而且初步探索了中药成分BBR在减压损伤预防中的价值,更重要的是发现了BBR减压暴露前单次用药或可达到多途径对抗减压损伤的效果,既为进一步发掘适应远海救生需求的快速药物干预措施提供了基础实验依据,又为军事健康和安全领域中医药手段的应用打开了新的研究思路。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R845.21;R-332
【图文】：

模拟舱,动物,高气压,定容

242加双蒸水后定容至 1000 ml4.0.01M PBS (pH=7.4)KH2PO40.27gNa2HPO41.14gNa2HPO4·7H2O 2.15 gNaH2PO4·2H2O 2.88gNaCl 8.00gKCl 0.20g加纯化水定容至 1000ml（六）高气压暴露方案高气压暴露使用海军医科大学特色医学中心水下医学实验室 112 动物快速上浮模拟舱。

生存分析,存活时间,大鼠

图 2 不同组别大鼠 DCS 起病时间和存活时间的生存分析A:不同组别大鼠 DCS 起病时间的生存分析;B:不同组别大鼠存活时间的生存分析.Figue 2 Comparison of the time of DCS onset and survial between different group’s animals.A:Comparison of the time of DCS onset between different group’s animals；B:Comparison ofthe time of survial between different group’s animals.表 2 不同组别大鼠 DCS 发病率和死亡率比较Table 2 Comparison of DCS icidence and motality of different group’s animals组别例数DCS 发病 DCS 死亡例数 % 例数 %control 10 0 0 0 0model 10 10 100a5 50.00am+BBR12.5+3h 10 9 90.00a3 30.00m+BBR25+3h 10 10 100.00a3 30.00m+BBR50+3h 10 10 100.00a4 40.00am+BBR50+3d 10 9 90.00a4 40.00a备注：“a”表示与对空白组相比 p < 0.05.

低剂量,预处理,苏木精,伊红

图 3 不同组别大鼠肺湿干比比较空白组相比 p < 0.05.f lung tissue wet-dry ratio between different group’s an较发现，与正常对照组相比，模型组、低剂量7，p低剂量组=0.001，p中剂量组=0.007）；与模型组相；3h 预处理组之间（低剂量组、中剂量组、高药时间长短（高剂量组 vs 长时间用药组）对病理改变病理切片的苏木精伊红（hematoxylin eosin，H动物，明显肺间质水肿和白细胞浸润；同时可内凝血。BBR 预处理明显减轻了减压负荷导致

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