镉对小鼠肝细胞自噬与溶酶体功能的影响及葛根素的保护效应
发布时间：2020-07-24 00:13
【摘要】：金属元素镉是分布广泛的环境污染物。镉经消化道或呼吸道进入机体后,在多个器官中蓄积,并引起急性或慢性损伤。肝脏是镉蓄积和损伤的重要靶器官之一,近些年研究发现,镉能够诱导肝细胞自噬,并且适当的自噬是细胞抵抗镉毒性损伤的保护机制。葛根素是中草药葛根中的主要化学成分,具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、提高免疫力等多种功效。研究发现,葛根素能够诱导细胞自噬,减轻镉引起的细胞损伤,但其具体机制尚不明确。本试验以小鼠正常肝细胞系AML12细胞为研究对象,通过氯化镉与葛根素单独或联合处理细胞,利用细胞分子生物学相关方法,探究镉暴露对肝细胞自噬与溶酶体功能的影响及葛根素的保护效应,为进一步揭示镉的毒性机制以及镉中毒防治提供理论依据。1.葛根素对镉致AML12细胞损伤的保护效应为了探讨葛根素在镉致AML12细胞损伤中的作用,本研究通过镉与葛根素单独或联合处理细胞,用xCELLigence细胞实时分析系统(Real-time cell analysis,RTCA)检测细胞指数(Cell index,CI),倒置荧光显微镜观察细胞形态,Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态,透射电子显微镜观察细胞超微结构。结果表明,镉暴露引起AML12细胞损伤,主要表现为抑制CI上升速度;引起细胞形态与细胞核形态改变;破坏细胞超微结构。葛根素能够缓解镉引起的上述损伤。2.镉对AML12细胞自噬的影响及葛根素的保护效应为了探究自噬在镉致AML12细胞损伤中的作用,以及葛根素的保护作用。本试验以5 μM镉与200μM葛根素单独或联合处理细胞12 h,透射电子显微镜观察自噬小体变化,MDC荧光染色观察自噬水平变化,免疫荧光法观察LC3聚点变化;5μM镉处理细胞不同时间(0、3、6、12、24 h)、不同浓度镉(0、2.5、5、10μM)处理细胞12 h,免疫印迹法检测自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1、LC3Ⅱ、P62的表达水平;5 μM镉分别与50 nM Bafilomycin A1(Baf)、200μM葛根素单独或联合处理细胞12h,免疫印迹法检测细胞自噬流变化;5μM镉分别与50 nM Baf、50 nM RAPA单独或联合处理细胞,RTCA监测CI变化。结果表明,镉诱导AML12细胞自噬水平升高,且在5 μM镉处理细胞12 h时,自噬水平最高(P0.01);镉暴露引起细胞自噬流阻滞,自噬流阻滞加剧了镉对细胞的毒性损伤;葛根素可诱导细胞发生自噬,缓解镉引起的自噬流阻滞,进而对镉引起的细胞损伤具有一定的保护效应。3.镉对AML12细胞溶酶体功能的影响及葛根素的保护效应为了探讨镉致AML12细胞自噬流阻滞的可能机制,以及葛根素的保护效应,本试验以5μM镉处理细胞不同时间(0、3、6、12、24 h)、不同浓度镉(0、2.5、5、10、20 μM)处理细胞12 h、5 μM镉与200 μM葛根素单独或联合处理细胞12 h,通过Lyso-Tracker Red(LTR)荧光染色,观察细胞溶酶体酸性环境的变化;免疫印迹法检测溶酶体相关膜蛋白2(Lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)、组织蛋白酶 B(Cathepsin B,CTSB)以及Rab7的表达。5 μM镉与200 μM葛根素单独或联合处理细胞12 h、Baf处理细胞12 h、EBSS处理细胞12 h,通过DQ-BSA-Green降解实验,检测溶酶体降解功能。50 nM RAPA单独处理细胞 12 h、5 μM 镉分别与 200 μM 葛根素、50 nM Thapsigargin(TG)、50 nM Baf单独或联合处理细胞12 h,免疫荧光法观察LAMP2与LC3共定位情况。结果表明,镉暴露引起AML12细胞溶酶体活化,主要表现为溶酶体酸化、LAMP2与CTSB的表达增加;镉促进溶酶体降解功能但导致LAMP2与LC3共定位减少;此外,镉抑制Rab7的表达,且呈时间-剂量效应关系;葛根素与镉共处理可进一步促进溶酶体活化,有效恢复LAMP2与LC3共定位并增加Rab7的表达。综上所述,镉暴露引起AML12细胞损伤,并促进细胞自噬,同时引起自噬流阻滞,自噬流阻滞进一步加剧镉暴露对细胞的毒性损伤;镉诱导AML12细胞溶酶体活化,促进溶酶体降解功能,抑制溶酶体与自噬体融合;此外,镉抑制调控溶酶体与自噬体融合的关键调节蛋白Rap7的表达;葛根素可促进AML12细胞自噬,可缓解镉引起的细胞损伤,其内在机制可能与葛根素恢复自噬体与溶酶体融合,恢复Rab7的表达,进而缓解镉引起的自噬流阻滞有关。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R-332;R595.2
【图文】：
能够清除细胞内受损的细胞器、错误折叠的蛋白质以及脂滴，并释放质供细胞循环利用。此外，自噬也能够清除细胞内的病原体，因此，自噬也被认为的一种生存机制［８￣。自噬在生理状态与病理状态下均可发生，细胞处于饥饿、缺氧刺激、病原入侵以及其他方式对细胞造成应激的状态下，自噬可被快速激活，清除物为细胞提供能量和营养物质，在维持细胞内细胞器与蛋白质的完整性以及免疫调挥重要调节作用［８５，８６］。逡逑如图１－２－１所示，自噬可分为分子伴侣自噬、微自噬以及巨自噬。分子伴侣自于待降解底物的特定序列（ＫＦＥＲＱ）与分子伴侣热休克相关蛋白７０邋（ＨＳＰ７０）的识合，具有高度选择性。被识别后的底物最终与溶酶体膜上的受体蛋白ＬＡＭＰ－２Ａ结溶酶体融合进行降解［８６］。与分子伴侣自噬相比，微自噬的过程要相对简单，微自噬自噬体的参与，对降解底物没有选择性。微自噬是溶酶体膜内陷直接捕获受损细胞可溶性蛋白转运入溶酶体降解的过程。但在真核细胞中微自噬很少发生，介导微自机制尚不明确［８７］。巨自噬是真核细胞中普遍存在的自噬方式，受多种基因调控，由节组成，是最复杂也是最具自噬特征性的自噬方式［８８＃。巨自噬通常被简称为自。逡逑
０逦扬州大学硕士学位论文逦逡逑范围，检测ＣＩ的变化。结果如图２－１－１所示，ＣＩ达到２．５？３时，细胞进入快速生长期，逡逑速生长期是处理细胞的最佳时期，根据实验需要同时为了方便安排实验时间，最终选择逡逑孔接种１．２Ｘ１０４个细胞进行后续实验，待ＣＩ达到２．５？３时处理细胞。逡逑－５０００邋１逦＊邋＊邋——１邋？逦Ｉｌｌｌ－ｉ－邋ＩＩ邋ＭｌｉｌｌｌｌｌＪｉｉｈｎｔ邋．ｎｍｉｌＭ邋ｉｎｉｌ－邋ＭＰ邋ｍｎ－邋；邋？逡逑．．
２－１－５Ａ）。与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比，Ｐｕｅ组细胞增殖速度与细胞形态无显著差异，Ｃｄ单独处理组逡逑细胞X椫乘俣燃趸海赴翁浠飨圆⒊鱿炙劳鱿赴挥耄茫涞ザ来碜橄啾龋校酰逵脲义希茫涔泊碜椋赴翁浠兴航猓ㄍ迹玻保靛澹拢Ｌ崾荆茫湟鸬模粒停蹋保蚕赴鹕顺叔义鲜奔洌亮啃в叵担校酰蹇苫航猓茫湟鸬南赴鹕耍耄遥裕茫练从车慕峁恢隆ｅ义希玻掣鸶卦陲又拢粒停蹋保蚕赴诵翁鹕酥械谋；ぷ饔缅义媳臼匝榻岷瞎鄄煜赴诵翁谋浠徊教教郑茫渲拢粒停蹋保蚕赴拘运鹕思埃校酰邋义系谋；ぷ饔谩２煌ǘ
本文编号：2768026
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R-332;R595.2
【图文】：
能够清除细胞内受损的细胞器、错误折叠的蛋白质以及脂滴，并释放质供细胞循环利用。此外，自噬也能够清除细胞内的病原体，因此，自噬也被认为的一种生存机制［８￣。自噬在生理状态与病理状态下均可发生，细胞处于饥饿、缺氧刺激、病原入侵以及其他方式对细胞造成应激的状态下，自噬可被快速激活，清除物为细胞提供能量和营养物质，在维持细胞内细胞器与蛋白质的完整性以及免疫调挥重要调节作用［８５，８６］。逡逑如图１－２－１所示，自噬可分为分子伴侣自噬、微自噬以及巨自噬。分子伴侣自于待降解底物的特定序列（ＫＦＥＲＱ）与分子伴侣热休克相关蛋白７０邋（ＨＳＰ７０）的识合，具有高度选择性。被识别后的底物最终与溶酶体膜上的受体蛋白ＬＡＭＰ－２Ａ结溶酶体融合进行降解［８６］。与分子伴侣自噬相比，微自噬的过程要相对简单，微自噬自噬体的参与，对降解底物没有选择性。微自噬是溶酶体膜内陷直接捕获受损细胞可溶性蛋白转运入溶酶体降解的过程。但在真核细胞中微自噬很少发生，介导微自机制尚不明确［８７］。巨自噬是真核细胞中普遍存在的自噬方式，受多种基因调控，由节组成，是最复杂也是最具自噬特征性的自噬方式［８８＃。巨自噬通常被简称为自。逡逑
０逦扬州大学硕士学位论文逦逡逑范围，检测ＣＩ的变化。结果如图２－１－１所示，ＣＩ达到２．５？３时，细胞进入快速生长期，逡逑速生长期是处理细胞的最佳时期，根据实验需要同时为了方便安排实验时间，最终选择逡逑孔接种１．２Ｘ１０４个细胞进行后续实验，待ＣＩ达到２．５？３时处理细胞。逡逑－５０００邋１逦＊邋＊邋——１邋？逦Ｉｌｌｌ－ｉ－邋ＩＩ邋ＭｌｉｌｌｌｌｌＪｉｉｈｎｔ邋．ｎｍｉｌＭ邋ｉｎｉｌ－邋ＭＰ邋ｍｎ－邋；邋？逡逑．．
２－１－５Ａ）。与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比，Ｐｕｅ组细胞增殖速度与细胞形态无显著差异，Ｃｄ单独处理组逡逑细胞X椫乘俣燃趸海赴翁浠飨圆⒊鱿炙劳鱿赴挥耄茫涞ザ来碜橄啾龋校酰逵脲义希茫涔泊碜椋赴翁浠兴航猓ㄍ迹玻保靛澹拢Ｌ崾荆茫湟鸬模粒停蹋保蚕赴鹕顺叔义鲜奔洌亮啃в叵担校酰蹇苫航猓茫湟鸬南赴鹕耍耄遥裕茫练从车慕峁恢隆ｅ义希玻掣鸶卦陲又拢粒停蹋保蚕赴诵翁鹕酥械谋；ぷ饔缅义媳臼匝榻岷瞎鄄煜赴诵翁谋浠徊教教郑茫渲拢粒停蹋保蚕赴拘运鹕思埃校酰邋义系谋；ぷ饔谩２煌ǘ
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