戊型肝炎病毒开放读码框3蛋白在HEV免疫逃逸中的作用及机制研究
发布时间：2020-07-24 15:09
【摘要】：戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染是世界性的公共卫生问题,全球每年约2000万人新发感染HEV。尽管临床上戊型肝炎病程多呈急性自限性,但在部分特殊患者如器官移植、HIV、孕妇等人群中,极易发生肝衰竭或戊型肝炎慢性化。HEV感染慢性化、致肝硬化等患者及孕妇高病死率的机制尚不明确,亟待进一步研究。巨噬细胞是天然免疫的重要组成部分,不仅可以吞噬并分泌多种炎性因子来消灭入侵的病原体,还可以起到抗原提呈作用连接天然免疫和特异性免疫应答,协助清除被感染的细胞。同时,病毒感染会通过模式识别受体启动先天抗病毒免疫反应,诱导宿主细胞分泌干扰素来限制病毒复制及扩散。但大部分病毒都已经进化出多种不同的策略来逃避宿主的免疫清除。目前研究证实戊型肝炎病毒开放读码框3蛋白(Open Reading Frame 3,ORF3)可以与宿主细胞内蛋白相互作用为HEV复制和疾病进展创造良好的环境,在HEV感染和传播过程中起着关键作用。因此,我们推测HEVORF3可能会影响巨噬细胞的免疫功能及其吞噬功能等,从而为HEV感染的慢性化,甚至继发肝纤维化和肝硬化提供良好的免疫抑制环境。另外,HEVORF3还可能会影响模式识别受体来抑制宿主细胞内的抗病毒免疫反应,帮助HEV逃逸免疫,维持持续复制状态。目的:1.构建HEV ORF3过表达载体,并建立不同感染模型的条件;2.明确HEVORF3对巨噬细胞极化的调控及对炎症因子、趋化因子表达的影响;3.研究HEV ORF3对巨噬细胞吞噬功能、吞噬相关受体的影响;4.研究HEV ORF3对宿主细胞模式识别受体及其内源性干扰素生成的调控作用,并进一步探究其可能的作用机制。方法:1.分别构建多种HEVORF3蛋白的过表达载体,包括慢病毒、腺病毒及质粒载体,并进行扩增和提纯;2.巨噬细胞模型采用佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导人急性单核细胞白血病(THP1)细胞系分化为PMA-THP1巨噬细胞,过表达上述过表达载体并筛选合适的试验条件;根据人正常肝脏细胞L02细胞系、人肝癌细胞HepG2及Huh7细胞系中TLR7的表达水平,选择合适的宿主细胞模型;3.PMA-THP1巨噬细胞中感染慢病毒或腺病毒载体后,给予细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后,利用ELISA、实时荧光定量PCR、Western blot等方法明确HEV ORF3对巨噬细胞炎症及趋化因子表达的影响,并进一步验证HEVORF3可以通过抑制NFκB信号通路来下调巨噬细胞炎症及趋化因子的释放;4.采用流氏细胞检测及吞噬试验等方法明确HEV ORF3对巨噬细胞吞噬功能的抑制作用,并进一步采用实时荧光定量PCR、Western blot等方法筛选出受调节的吞噬相关受体蛋白,结合激动剂及抑制剂的使用,探讨可能的机制;5.分别在PMA-THP1巨噬细胞和L02细胞中过表达腺病毒及质粒载体,研究HEV ORF3对宿主细胞内源性干扰素的表达有调控作用。进一步采取实时荧光定量PCR、Western blot等方法筛选显著表达差异的模式识别受体,结合特异性信号通路调节剂,研究HEVORF3逃逸宿主细胞固有免疫作用的可能机制。结果:1.成功构建基因1型HEV ORF3片段的慢病毒、腺病毒及质粒载体,并进行了扩增和提纯;2.10ng/mL PMA持续诱导THP1分化24h后,换为完全培养基继续培养24h即分化为成熟巨噬细胞;L02细胞系作为人正常肝脏细胞的永生化细胞系仍有具有正常肝细胞的特征,且其TLR7的表达水平明显高于HepG2及Huh7细胞系,因此被本研究作为宿主细胞模型。3.ELISA及RT-qPCR结果提示HEV ORF3可以下调LPS诱导PMA-THP1巨噬细胞生成的炎症因子和趋化因子的表达和分泌,且可能是通过下调TLR4并抑制NFκB信号通路活性发挥作用的;4.流式细胞检测及吞噬试验发现HEV ORF3可以明显抑制巨噬细胞的吞噬功能,RT-qPCR和western blot结果显示吞噬相关受体CD14和CD64的表达有明显降低,且CD14和CD64的下调可以通过JAK1/STAT1信号通路的特异性抑制剂ruxolinitib治疗后逆转;5.ELISA及RT-qPCR结果提示HEV ORF3可以明显抑制PMA-THP1及L02细胞中Ⅰ型内源性干扰素的产生,而进一步的RT-qPCR及western blot结果显示TLR3和TLR7的表达有明显下降,结合特异性激动剂和抑制剂研究发现,HEVORF3过表达后可抑制多条信号通路包括p-P65、p-STAT1和p-JNK的活化水平,从而造成TLR7和干扰素的表达下调。结论:1.HEV ORF3可以通过下调TLR4并抑制NFκB信号通路活性降低LPS诱导PMA-THP1巨噬细胞的炎症和趋化因子的表达水平;2.HEV ORF3可以通过抑制JAK1/STAT1信号通路下调吞噬相关受体CD14和CD64的表达,并抑制巨噬细胞的吞噬功能;3.HEV ORF3蛋白可以通过下调TLR3和TLR7,抑制Ⅰ型内源性干扰素的产生。并且可以抑制多条信号通路包括NFκB,JAK/STAT和JNK/MAPK来下调TLR7蛋白的表达;4.HEV ORF3蛋白可以通过上述多种作用途径帮助HEV逃逸宿主免疫清除,为戊型肝炎慢性化的可能机制提供理论支持和补充。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：
以ＧＡＰＤＨ作为内参，计算出目的蛋白的相对表达量。逡逑．１０统计学分析逡逑使用ＳＰＳＳ１９．０对实验数据进行统计分析，Ｐ邋＜邋０．０５为差异具有统计学意义。逡逑组间比较采用ｔ检验。计量资料以ＭＥＡＮ邋±邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｄｅｖｉａｔｉｏｎ表示，至少进行３逡逑独立重复实验。逡逑结果逡逑．１邋ＰＣＲ扩增ＯＲＦ３基因片段的电泳鉴定逡逑质粒中ＯＲＦ３基因全长为４１５ｂｐ，ＰＣＲ法扩增该片段，琼脂糖凝胶电泳显示在逡逑４１５ｂｐ处有明显的目的条带，电泳结果显示条带符合理论结果（图１Ａ）。目的载体经逡逑ｃｏＲ邋Ｉ－ＨＦ和ＢａｍＨ邋Ｉ－ＨＦ酶切后如图１Ｂ所示，回收４７５８ｂｐ的载体片段。逡逑
２．４重组腺病毒感染２９３细胞及鉴定逡逑将重组腺病毒以ＭＯＩ邋２０感染ＰＭＡ－ＴＨＰ１细胞，４８ｈ时显微镜下观察荧光表达逡逑效率约为９０％邋（图４）。逡逑■■逡逑图４．腺病毒感染ＰＭＡ－ＴＨＰ１细胞（ｘ２００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４．邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｒａｔｅ邋ｉｎ邋ＰＭＡ－ＴＨＰ１邋ｃｅｌｌｓ邋（３６邋ｈ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，邋ｘ２００）．逡逑３９逡逑
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本文编号：2769012
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：
以ＧＡＰＤＨ作为内参，计算出目的蛋白的相对表达量。逡逑．１０统计学分析逡逑使用ＳＰＳＳ１９．０对实验数据进行统计分析，Ｐ邋＜邋０．０５为差异具有统计学意义。逡逑组间比较采用ｔ检验。计量资料以ＭＥＡＮ邋±邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｄｅｖｉａｔｉｏｎ表示，至少进行３逡逑独立重复实验。逡逑结果逡逑．１邋ＰＣＲ扩增ＯＲＦ３基因片段的电泳鉴定逡逑质粒中ＯＲＦ３基因全长为４１５ｂｐ，ＰＣＲ法扩增该片段，琼脂糖凝胶电泳显示在逡逑４１５ｂｐ处有明显的目的条带，电泳结果显示条带符合理论结果（图１Ａ）。目的载体经逡逑ｃｏＲ邋Ｉ－ＨＦ和ＢａｍＨ邋Ｉ－ＨＦ酶切后如图１Ｂ所示，回收４７５８ｂｐ的载体片段。逡逑
２．４重组腺病毒感染２９３细胞及鉴定逡逑将重组腺病毒以ＭＯＩ邋２０感染ＰＭＡ－ＴＨＰ１细胞，４８ｈ时显微镜下观察荧光表达逡逑效率约为９０％邋（图４）。逡逑■■逡逑图４．腺病毒感染ＰＭＡ－ＴＨＰ１细胞（ｘ２００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４．邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｒａｔｅ邋ｉｎ邋ＰＭＡ－ＴＨＰ１邋ｃｅｌｌｓ邋（３６邋ｈ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，邋ｘ２００）．逡逑３９逡逑
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