A型流感病毒通用VLPs疫苗的研究与通用抗体的评价

发布时间：2020-07-24 16:09

【摘要】：A型流感病毒(IAV)是囊膜型的,分节段的,负链RNA病毒,属于正黏病毒科,流感病毒属。A型流感病毒由8个基因片段组成,每个基因片段编码至少一种蛋白质。迄今为止,IAV可编码13种病毒蛋白。基于病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原差异,可将IAV分为18个HA和11个NA亚型。近年来,跨越动物—人类宿主物种屏障的A型流感病毒的病毒数量愈来愈多,给人类健康带来严重威胁。目前,流感病毒疫苗是预防流感病毒的有效方法,特别是应对季节性流感的重要手段。然而,流感病毒的主要抗原血凝素(HA)易发生基因突变,当疫苗毒株与流行毒株不匹配时,增加了流感病毒在人间传播流行的风险。因此,A型流感病毒通用VLPs疫苗与通用抗体的研究,对于应对抗原漂移变异后的流感病毒在人、动物间的流行具有重要意义。一、通用型流感病毒疫苗的研究方向主要有以下几个:血凝素HA茎部蛋白;膜蛋白M2离子通道的胞外域蛋白(M2e);内部核蛋白(NP)和基质蛋白(M1)。本研究选择高致病性禽流感病毒H5N1 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(SH-lclade 2.3.2.1;group 1)的 HA 茎部蛋白(HA Stem Protein,HLHA)、核蛋白(Nuclear protein,NP)、基质蛋白(Matrix Protein,M1)和A型流感病毒的融合蛋白5M2e(2个人源、1个猪源和2个禽源),及融合蛋白HL5M2e(5M2e嵌合入HLHA以替补HA头部的位置)为靶抗原,通过昆虫—杆状病毒表达系统来构建和制备AIV VLPs,并对其进行免疫原性研究。通过滴鼻途径免疫小鼠,3种AIV VLPs对BALB/c小鼠呈现出80%-90%不等的保护率。所有数据显示,HL5M2e VLPs的免疫原性最好。因此,以HL5M2e VLPs为基础开发通用型AIV疫苗具有潜在的发展空间。二、考虑到免疫接种的疫苗应以能够诱导小鼠的黏膜免疫为主,使小鼠能够获得足够的黏膜免疫抗体sIgA,做好第一道防线。基于此,在HL5M2e VLPs的基础上,又拯救了表达黏膜佐剂融合蛋白 glycosylphosphatidylinositol-anchored CCL28(GPI-CCL28)和 glycosylphosphatidylinositol-anchored GM-CSF(GPI-GM-CSF)基因的重组杆状病毒,制备出嵌合型AIV cVLPs(CCL28 cVLPs、GM-CSF cVLPs和CCL28/GM-CSF cVLPs)。与 AIV 病毒样颗粒 HL5M2e VLPs(含 HL5M2e、NP 和Ml)相比,可保护BALB/c小鼠对不同亚型的A型流感病毒的攻击呈现不同的存活率:同源 H5N1 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(SH-1;clade 2.3.2.1;group 1)可达100%;异源鼠适应株H1N1 A/Changchun/01/2009(group 1)可达50%-60%;异源鼠适应株 H3N2 A/baikal teal/Shanghai/SH-89/2013(group 2)可达 40-50%和异源鼠适应株 H7N7 A/Lesser White-fronted goose/HuNan/412/2010(group 2)可达 10-20%。通过滴鼻免疫结果显示,嵌合了 CCL28和GM-CSF的嵌合型AIV cVLPs可作为一种具有交叉保护活性的A型流感病毒疫苗候选株,为研发能够针对不同亚型A型流感病毒的通用型流感疫苗奠定实验室基础。三、对3株A型流感病毒通用型人源化抗体F10、H98和H40进行了构建和表达,以及体外血凝抑制活性和中和活性的鉴定。结果显示,人源化mAb Fl0比其它两种人源化mAb具有更高的中和滴度和更宽的中和范围,可作为用于构建随机突变抗体库的基础抗体,为接下来的抗体筛选工作奠定了实验室基础。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392
【图文】：

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋Ａ邋ｖｉｒｕｓｆ３７］逡逑１．邋３流感的流行病学逡逑自１９９６年以来，据报道有超过１４种Ａ型流感病毒亚型引起人类感染（图１．邋２）。逡逑大多数引起人类感染的流感亚型来自禽类，而只有少数来自猪，包括Ａ型流感病毒逡逑（Ｈ１Ｎ１）邋ｐｄｍ０９，邋Ａ型流感病毒（Ｈ１Ｎ１）邋ｖ和Ａ型流感病毒（Ｈ３Ｎ２）邋ｖ［３８－４３］。过逡逑去三年的期间，特别是在中国，更多亚型的Ａ型流感病毒己跨越物种障碍而引起人逡逑类感染的病例比以往任何时候都更多，活禽市场更为严重。大多数Ａ型流感病毒仅逡逑在人类中引起零星或小群感染。在迄今为止报告的所有Ａ型流感病毒中，Ａ型流感逡逑病毒Ｈ１Ｎ１邋ｐｄｍ０９，Ａ型流感病毒Ｈ５Ｎ１和Ａ型流感病毒Ｈ７Ｎ９己被证实在人类中逡逑可引起大规模爆发，并导致升高的死亡率和发病率。Ａ型流感病毒（Ｈ１Ｎ１）邋ｐｄｍ０９逡逑于２００９年出现并引起全球大流行

流感疫苗制备方法，如ＤＮＡ疫苗，病毒载体疫苗，病毒样颗粒疫苗，细胞培养技逡逑术疫苗，重组ＤＮＡ疫苗，新型减毒活疫苗和佐剂疫苗，以改善疫苗开发和免疫原逡逑性（图１．３）邋［１２Ｇ，１２１Ｌ水包油佐剂，例如ＭＦ５９和ＡＳ０３，改善对灭活流感疫苗的免逡逑疫反应，特别是在幼儿（６个月及以上）和６０岁以上的人群中作用显著。几种此类逡逑季节性流感疫苗已在欧洲和北美洲的美国获得许可。一般来说，水包油佐剂具有良逡逑好的免疫耐受性，其副作用类似于非佐剂灭活疫苗。然而，欧洲回顾性研宄的结果逡逑表明邋Ｐａｎｄｅｍｒｉｘ邋（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）和邋ＡＳ０３邋佐剂的邋ＨｌＮｌｐｄｍ０９邋疫苗，与随后在邋２１逡逑岁以下接种疫苗的个体中发生嗜睡症之间存在关联。ＡＳ０３佐剂在这种关联中的作逡逑用尚不清楚，其它因素包括特定的ＨＬＡ类型可能有一定的作用Ｐ２－１２４］。具有广泛交逡逑叉保护活性的通用流感疫苗可以取代年度季节性流感疫苗接种，并对新出现的流感逡逑病毒提供保护。一种新型基于各种流感病毒靶标的通用疫苗，如血凝素茎部蛋白，逡逑１３逡逑

学院北京协和医学院博士学位论文３１］。由于上述原因，迫切需要可以有效防止漂移变异的流感病毒疫苗，来应对人畜共患流感病毒感染和新的大流行性流感病毒。应答重新定向到病毒的保守位点来实现。逡逑是普遍或广泛保护的疫苗？通用流感病毒疫苗是覆盖所有Ａ型苗，不依赖于抗原漂移或ＨＡ／神经氨酸酶（ＮＡ）亚型。这将包１１种ＮＡ亚型的Ａ型流感病毒，Ｖｉｃｔｏｒｉａ和ａｎｃｅｓｔｒａｌ的Ｂ型流节性流感病毒毒株的未来漂移变异相比之下，广泛保护疫苗被定义为涵盖大部分流感病毒的疫苗，例如所有人类季节性１Ｎ１，Ｈ３Ｎ２和Ｂ型流感）。为了设计这些类型的疫苗，需要确定构域／蛋白质。这些疫苗的保护机制在很大程度上取决于所选择的疫苗的接种方法和策略。通用流感病毒疫苗设计的几个靶点，包，Ｍ２离子通道的胞外域（Ｍ２ｅ）和内部蛋白质核蛋白（ＮＰ）和（图邋１．４）逡逑（ａ）逦（逦（ｂ）逦逡逑

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