COX2-PGD2-DPs途径介导孕期炎症增强LPS致子代大鼠脑损伤机制

发布时间：2020-07-27 16:33

【摘要】：越来越多的研究表明,炎症性损伤是导致中枢神经系统疾病如抑郁症、阿尔茨海默病等的重要发病机制。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为经典的炎症刺激因子,它与受体结合后启动一系列的磷酸化过程,促进转录因子-κB(transcription factor-κB,NF-κB)进入细胞核释放大量的炎症因子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素6(interleukin 6,IL-6)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素10(interleukin 10,IL-10)等。最近的一项研究表明,子宫内暴露于感染/炎症的后代患自闭症的风险显著增高。推测孕期暴露炎症可能会增加子代大鼠脑损伤易感性,但具体机制仍然未知。众所周知,COX2在炎症相关性疾病中扮演了重要角色。花生四烯酸通过COX氧化后产生的所有PGs中,前列腺素D2(prostaglandin D2,PGD2)是人体脑中含量最丰富的前列腺素。PGD2通过前列腺素D1受体(prostaglandin D1 receptor,DP1)和前列腺素D2受体(prostaglandin D2 receptor,DP2)在各种生理和病理生理过程中发挥着重要作用。本研究主要观察孕期炎症对子代大鼠LPS致脑损伤易感性的影响,并从COX2-PGD2-DPs途径初步探讨其机制。第一部分孕期炎症对LPS致子代成年大鼠脑损伤的影响目的:观察孕期炎症刺激对LPS致子代成年大鼠脑损伤的影响,以及大鼠脑组织COX2-PGD2-DPs途径变化特征;通过COX2干预初步明确COX2-PGD2-DPs途径与孕期炎症影响子代成年大鼠对LPS脑损伤易感性的相关性。方法:1.孕期炎症模型的建立通过检查阴栓获得准确妊娠时间(见阴栓当天为孕龄第1天)的孕鼠雌性SD大鼠,30只孕鼠于妊娠期第11、14和18天分别给予腹腔注射300μg/kgLPS(n=21)或等体积无菌生理盐水(normal saline,NS)(n=9),子代大鼠,由孕鼠繁殖。在4周龄时各组子代大鼠断乳,雌雄分笼饲养。2.子代大鼠LPS诱导脑损伤模型的建立孕期LPS或NS处理的子代大鼠在第60天时随机选取70只雄鼠用于该实验造模,双侧侧脑室各注射5μl LPS(12μg/μl)或等体积人工脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)。3.实验分组实验分7组:正常对照组(NS+CSF)、产前炎症组(LPS+CSF)、产后炎症组(NS+LPS)、产前产后炎症双刺激组(LPS+LPS)、产前炎症+美洛昔康(meloxicam,MXC)组(LPS+CSF+MXC)、产后炎症+MXC组(NS+LPS+MXC)和产前产后炎症双刺激+MXC组(LPS+LPS+MXC),n=10。造模后第二天开始连续一周灌胃给予3mg/kg美洛昔康,其余组给予等体积0.5%CMC。4.主要观察指标及方法采用水迷宫实验、旷场实验和自发活动测试,检测子代大鼠行为学改变情况;采用HE染色,观察海马及皮层病理学改变;ELISA法检测大鼠海马及皮层中PGD2、IL-6、TNF-α、IL-1β的含量;生化酶学方法检测大鼠海马及皮层中SOD活性及MDA含量;Western blot检测APP、Aβ、COX2、DP1和DP2蛋白表达。结果:1.与NS+CSF组相比,LPS+CSF组大鼠寻台潜伏期延长,穿梭平台次数减少,探究行为及自发运动活动减少;皮层及海马神经元有少量的核深染/固缩;皮层PGD2和TNF-α的含量明显升高;海马IL-6和IL-1β的含量明显升高;皮层MDA含量显著增加、皮层及海马SOD活性显著下降;皮层Aβ、COX2、DP2蛋白表达明显升高,DP1蛋白表达明显降低;海马APP、Aβ和COX2蛋白表达明显升高;而大鼠皮层IL-1β、IL-6含量和APP蛋白表达无显著性差异,海马TNF-α、PGD2、MDA水平和DP1、DP2蛋白表达无显著性差异。2.与NS+CSF组相比,NS+LPS和LPS+LPS组大鼠寻台潜伏期延长,穿梭平台次数减少,探究行为及自发运动活动减少;皮层及海马神经元有明显的核固缩/深染;皮层及海马PGD2、IL-6、IL-1β的含量明显升高;MDA含量显著增加、SOD活性显著下降;APP、Aβ、COX2、DP2蛋白表达明显升高,DP1蛋白表达明显降低;而NS+CSF组与NS+LPS组间大鼠海马TNF-α无显著性差异。3.与NS+LPS组相比,LPS+LPS组大鼠寻台潜伏期延长,穿梭平台次数减少,水平运动及自发运动活动减少;皮层及海马神经元有明显的核固缩/深染;皮层IL-6和IL-1β的含量明显升高,海马PGD2和IL-6含量明显升高;海马MDA含量显著增加;皮层及海马SOD活性显著下降、APP、Aβ、COX2和DP2蛋白表达明显升高,DP1蛋白表达明显降低;而皮层PGD2、TNF-α和MDA水平无显著性差异,海马IL-1β和TNF-α水平无显著性差异。4.与LPS+LPS组相比,LPS+LPS+MXC组大鼠寻台潜伏期缩短,穿梭平台次数增加,探索行为及自发运动活动增加;皮层及海马核固缩、深染减少,皮层IL-6、TNF-α和IL-1β的含量明显降低;海马PGD2和IL-6的含量明显降低;皮层及海马SOD活性显著上升、皮层MDA含量显著降低;皮层Aβ、COX2和DP2蛋白表达明显降低;海马APP、Aβ、COX2和DP2蛋白表达明显降低,DP1蛋白表达明显增加;而大鼠皮层PGD2水平和DP1、APP蛋白表达无显著性差异,海马MDA、TNF-α、IL-1β水平无显著性差异。结论:1.孕期炎症刺激可引起子代成年大鼠行为和病理异常。2.孕期炎症刺激可引起子代大鼠皮层COX2表达增加,DP2表达增加,而DP1表达降低。3.孕期炎症刺激可增加子代大鼠成年后对LPS诱导脑损伤易感性;其机制可能与COX2-PGD2-DPs平衡失调,进而导致氧化应激与炎症反应,增加Aβ和APP蛋白表达有关。4.美洛昔康对LPS致孕期炎症刺激子代大鼠脑损伤有明显的保护作用,其机制可能与抑制COX2活性,重建COX2-PGD2-DPs平衡,进而减轻氧化应激与炎症反应有关。第二部分孕期炎症对LPS致子代大鼠原代神经元损伤的影响目的:观察孕期炎症刺激子代大鼠原代神经元对LPS致神经元损伤的易感性,并从COX2-PGD2-DPs途径初步探讨其机制。方法:1.SD大鼠原代神经元培养及LPS诱导神经元损伤模型的建立(1)通过检查阴栓获得准确妊娠时间(见阴栓当天为孕龄第1天)的孕鼠雌性SD大鼠,孕鼠于妊娠期第11、14和18天给予腹腔注射300μg/kgLPS或等体积无菌生理盐水NS。(2)选取24h内新生乳鼠,离体培养原代神经元,神经元培养至第7天,特异性烯醇化酶鉴定神经元;MTT法测定给药后细胞存活率,试剂盒测定LDH漏出率,确定LPS致神经元损伤的最适浓度和时间点。2.COX2干预对LPS致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的影响(1)采用正常(非孕期炎症处理)原代培养神经元,以及LPS致正常原代神经元损伤模型,以MTT法测定给药后细胞存活率,生化酶法测定细胞LDH漏出率,确定COX2抑制剂MXC有效浓度。(2)实验分组及观察指标分为7组:NS、LPS、NS+LPS、LPS+LPS、LPS+MXC、NS+LPS+MXC和LPS+LPS+MXC组,n=6。其中,NS组为孕期不给予炎症刺激;LPS组为孕期炎症子代大鼠原代神经元;NS+LPS组为孕期正常子代给予LPS;LPS+LPS组为孕期炎症+子代给予LPS双刺激。观察指标及方法:MTT法测定给药后细胞存活率,生化酶法测定细胞LDH漏出率;ELISA检测神经元PGD2、IL-6、TNF-α、IL-1β的含量;生化酶学检测神经元SOD活性及MDA含量;流式细胞术测定细胞凋亡;Western blot检测神经元APP、Aβ、COX2、DP1和DP2蛋白表达。3.DPs干预对LPS致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的影响(1)采用正常(非孕期炎症处理)原代培养神经元,以及LPS致正常原代神经元损伤模型,以MTT法测定细胞存活率,生化酶法测定细胞LDH漏出率,确定DP1激动剂(BW245C),DP1拮抗剂(BWA868C),DP2激动剂(DK-PGD2)和DP2拮抗剂(AZD1981)的有效浓度。(2)实验分组及观察指标分为7组:NS、LPS、NS+LPS、LPS+LPS、LPS+药物、NS+LPS+药物和LPS+LPS+药物组。药物分别为:DP1激动剂(BW245C),DP1拮抗剂(BWA868C),DP2激动剂(DK-PGD2)和DP2拮抗剂(AZD1981),n=6。观察指标及方法:MTT法测定给药后各组神经元存活率,生化酶法测定各组神经元LDH漏出率,流式细胞术测定各组神经元凋亡。结果:1.1μg/ml LPS作用于神经元24h,细胞存活率明显下降,而LDH漏出率明显增加。2.COX2干预对LPS致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的影响(1)与NS+LPS组相比,1×10~(-8)M MXC给药后能够显著提高LPS损伤神经元存活率,降低LDH漏出率,因此选择1×10~(-8)MMXC作为有效给药浓度。(2)与NS组相比,LPS组大鼠原代神经元MTT值明显降低;LDH漏出率明显升高;细胞凋亡增加;PGD2、TNF-α、IL-1β的含量明显升高;MDA含量显著增加、SOD活性显著下降;APP、Aβ、COX2和DP2蛋白表达水平显著增加;而DP1蛋白表达和IL-6含量无显著性差异。与NS组相比,NS+LPS和LPS+LPS组大鼠神经元MTT值明显降低;LDH漏出率明显升高;细胞凋亡增加;PGD2、IL-6、TNF-α、IL-1β的含量明显升高;MDA含量显著增加、SOD活性显著下降;APP、Aβ、COX2、DP1和DP2的蛋白表达水平显著增加。与NS+LPS组相比,LPS+LPS组大鼠神经元MTT值明显降低;LDH漏出率明显升高;细胞凋亡增加;SOD活性显著下降;APP、COX2、DP1和DP2的蛋白表达水平显著增加;而PGD2、IL-6、TNF-α、IL-1β和MDA含量和Aβ蛋白表达无明显差异。与LPS+LPS组相比,LPS+LPS+MXC组原代神经元MTT值明显升高;LDH漏出率明显降低;细胞凋亡减少;SOD活性显著上升;APP、Aβ、COX2和DP2的蛋白表达水平显著下降;而PGD2、IL-6、TNF-α、IL-1β及MDA含量和DP1蛋白表达无显著性差异。3.DPs干预对LPS致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的影响(1)与NS+LPS组相比,1×10~(-5) M DP1激动剂(BW245C)或1×10~(-5) MDP2拮抗剂(AZD1981)给药后能够显著提高LPS处理神经元存活率,降低LDH漏出率,因此选择1×10~(-5) M作为最佳给药浓度。与NS+LPS组相比,1×10~(-5) M DP1拮抗剂(BWA868C)或1×10~(-5) MDP2激动剂(DK-PGD2)给药后能够显著降低LPS诱导的神经元存活率,增加LDH漏出率,因此选择1×10~(-5) M作为最佳给药浓度。(2)与LPS+LPS处理相比,给予DP1激动剂(BW245C)或DP2拮抗剂(AZD1981)干预后,神经元存活率显著升高,LDH漏出率显著降低和细胞凋亡减少;而给予DP1拮抗剂(BWA868C)或DP2激动剂(DK-PGD2)干预后,神经元存活率显著降低,LDH漏出率显著升高,细胞凋亡增加。结论:1.孕期炎症子代大鼠原代神经元存活率下降、LDH漏出率增加,细胞凋亡增加;神经元COX2表达及下游产物表达明显增加。2.孕期炎症刺激增加子代神经元对LPS损伤的易感性。3.孕期炎症刺激增加子代神经元对LPS损伤易感性的机制可能涉及COX2-PGD2-DPs途径平衡失调。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R363
【图文】：

学习记忆功能,大鼠,子代,炎症

组织及器官有明显异常。因此，当给药完成时，每组中至少有9只大鼠。2.3 孕期炎症刺激对 LPS 处理子代大鼠学习记忆功能的影响如图1a所示，与NS+CSF组相比，LPS+CSF、NS+LPS和LPS+LPS组大鼠逃避潜伏期明显延长（P <0.05和P <0.01）。LPS+LPS组大鼠逃避潜伏期比NS+LPS组（P<0.05）和LPS+CSF组（P<0.05）明显延长。与LPS+CSF组大鼠相比，LPS+CSF+MXC组逃避潜伏期显著缩短（P<0.05）。与NS+LPS组大鼠相比，

旷场行为,大鼠,子代,炎症

旷场实验是研究啮齿动物的探索行为和自发运动活动的公认行为学工具。与NS+CSF组相比，LPS+CSF、NS+LPS和LPS+LPS组大鼠垂直运动，水平运动明显减少（P <0.05和P <0.01）（图2）；其中LPS+CSF组大鼠理毛次数和排泄次数没有显著变化；NS+LPS组大鼠理毛次数无显著差异。此外，与NS+LPS组相比，LPS+LPS组大鼠水平运动明显减少（P＜0.05）；但对于理毛次数，垂直运动和排泄次数没有显著影响。与LPS+CSF组相比，LPS+CSF+MXC组大鼠水平运动、

自发活动,大鼠,子代,炎症

P<0.01vs.LPS+LPS group.2.5 孕期炎症刺激对 LPS 处理子代大鼠自发活动的影响大鼠自发活动测试结果显示（图3），与NS+CSF组相比，LPS+CSF、NS+LPS和LPS+LPS组大鼠自发运动次数显著减少（P <0.05和P <0.01）。与LPS+CSF组相比，NS+LPS和LPS+LPS组大鼠自发活动次数明显减少（P <0.05和P <0.01）。另外，与NS+LPS组相比，LPS+LPS组大鼠自发活动次数显著减少(P＜0.05)。LPS+CSF组与LPS+CSF+MXC组间大鼠自发活动次数无明显差异。与NS+LPS组相比，NS+LPS+MXC组大鼠自发活动次数有增加趋势，但无显著性差异。与LPS+LPS组相比

【相似文献】