细菌鞭毛钩蛋白FlgE的致炎活性作用机制研究

发布时间：2020-07-27 19:53

【摘要】：第一部分细菌鞭毛钩蛋白FlgE诱导急性肺损伤的免疫机制目的:微生物成分与免疫系统的相互作用是病-宿互作的重要内容。但迄今为止,国内外对细菌鞭毛钩蛋白FlgE的免疫相关特性鲜有报道。课题组在之前研究中首次发现铜绿假单胞菌鞭毛钩蛋白FlgE具有显著的免疫调控功能,FlgE刺激HCEC和肺组织切片可活化多条与炎症、免疫反应相关的通路[1]。然而,FlgE作用机体后引起怎样的免疫效应仍不清楚。本部分以小鼠急性肺损伤模型为研究对象,阐述由FlgE刺激所引起的急性炎症的一般特点。方法:原核表达及纯化FlgE蛋白并去内毒素。FlgE(250mg/100mL)滴鼻建立小鼠急性肺损伤模型。观察滴鼻后24 h小鼠肺部病变情况。流式分析肺组织中浸润的免疫细胞的亚群及比例,同时检测脾脏中免疫细胞的变化。q-PCR检测肺组织中炎症因子的基因表达水平。ELISA检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF,Bronchoalveolar lavage fluid)中细胞因子的表达水平。荧光显微镜观察肺组织NETs产生情况,并用DNA定量试剂盒检测BALF中游离DNA的含量。另外,前期实验初步证实肺上皮细胞膜表面表达的CAV1(Caveolin-1)蛋白为FlgE的可能配体之一[1],本实验中分离CAV1基因敲除(Caveolin-1-/-)小鼠骨髓来源的中性粒细胞并给予FlgE刺激,q PCR检测炎症因子的表达。结果:成功制备去内毒素的FlgE蛋白。FlgE滴鼻24 h后成功建立小鼠急性肺损伤模型。在FlgE诱导的急性肺损伤中,浸润的免疫细胞主要是中性粒细胞,免疫消除中性粒细胞后炎症减轻。FlgE刺激后小鼠肺组织和BALF中细胞因子(如IL-1b、IL-6、IL-17A、IL-23、G-CSF)和中性粒细胞趋化因子(如CXCL1、CXCL2和CXCL5)的表达显著升高。FlgE刺激后ROS+中性粒细胞比例升高,而中性粒细胞凋亡不明显。此外,荧光显微镜下可见FlgE滴鼻后小鼠肺组织中有NETs样结构存在,同时BALF中DNA含量显著升高。然而,体外抑制中性粒细胞内ROS的产生并不能阻断其NETs的释放。此外,q PCR结果显示,CAV1基因缺失可显著降低FlgE刺激引起的中性粒细胞内炎症因子(如IL-1b、IL-6、IL-17A、CXCL1、CXCL2)的表达。结论:FlgE刺激小鼠引起炎症反应,其主要效应细胞是中性粒细胞。迁移到炎症部位的中性粒细胞以NETs形式发挥作用。此外,中性粒细胞膜表面CAV1蛋白可能为FlgE的结合分子之一。第二部分IL-17A在细菌鞭毛钩蛋白FlgE致炎活性中的作用目的:IL-17A是调节机体炎症反应的一个关键细胞因子,由多种细胞分泌。初步研究发现在FlgE滴鼻建立的小鼠急性肺炎模型中IL-17A的基因和蛋白表达水平均升高。因此本部着重探讨IL-17A的缺失对FlgE引起的急性炎症的影响。方法:应用野生型(WT,wild-type)小鼠和IL-17A基因敲除(Il17a-/-)小鼠,FlgE(250mg/100mL)滴鼻建立小鼠急性肺损伤模型,滴鼻24 h后处死小鼠收样检测。从组织症病变程度、免疫细胞细胞浸润水平以及细胞因子表达及分泌三个方面比较IL-17A缺失对的FlgE引起的急性肺炎的影响。分离WT小鼠和Il17a-/-小鼠的肺组织,给予FlgE刺激,建立体外培养模型[1],western blot检测FlgE刺激不同时间点肺组织中STAT3的磷酸化水平,transwell迁移实验比较FlgE刺激后两种小鼠肺-组织培养上清对中性粒细胞迁移和NETs形成的影响。Percoll密度梯度离心法分离野生型小鼠骨髓来源中性粒细胞,采用flow cyto、q PCR、western blot等方法检测中性粒细胞在FlgE刺激下后其自身IL-17A的表达和STAT3的磷酸化水平。结果:与WT小鼠相比,FlgE滴鼻后Il17a-/-小鼠肺组织炎性病变及免疫细胞浸润程度均明显减低,而预先免疫消除中性粒细胞后,FlgE引起的炎症反应程度在两种小鼠中均减弱。当IL-17A缺失后,除IL-23无明显差异外,来源于肺组织和BALF的细胞因子(如IL-1b、IL-6、G-CSF)和趋化因子(如CXCL1、CXCL2)的基因表达和蛋白分泌水平均显著降低。western blot检测FlgE刺激相同时间时肺组织切片中STAT3的磷酸化水平,发现,Il17a-/-小鼠肺组织切片中STAT3的活化水平低于WT小鼠肺片的活化水平。尽管用FlgE与野生型小鼠或Il17a-/-小鼠的肺片共培养上清(刺激时间24 h)做趋化剂都可以显著增加中性粒细胞迁移的数目,然而,当IL-17A缺失后此种趋化效应明显低于正常小鼠的趋化效应。另外,肺片经STAT3抑制剂预处理后其共培养上清趋化引起的中性粒细胞迁移数量减少。骨髓来源中性粒细胞在FlgE(5mg/m L、10mg/m L)刺激作用下IL-17A-IL-17RC的基因表达水平升高、STAT3的磷酸化程度增加。激光共聚焦显微镜下可见大量中性粒细胞核呈弥散网状结构(NETs,neutrophil extracellular trap)附着于WT小鼠的肺组织,同时BALF中游离DNA含量以及血清中MPO含量均明显升高,而IL-17A缺失后中性粒细胞核多呈典型分叶结构且DNA和MPO检出量亦远低于WT小鼠的含量。FlgE与WT小鼠肺组织共培养上清亦可引起明显的NETs释放现象,而IL-17A缺失后此种效应减弱。另外,FlgE单独刺激中性粒细胞可引起NETs释放,而IL-17A单独作用并不能引起NETs的产生。结论:在FlgE引起的急性肺损伤中,IL-17A通过肺组织促进趋化因子(如CXCL1、CXCL2)的表达进而募集中性粒细胞至炎症部位,此过程受STAT3的调节。侵润的中性粒细胞产生NETs释放。FlgE可直接刺激中性粒细胞表达IL-17A、上调STAT3的磷酸化水平。第三部分细胞膜表面ATP5B介导FlgE对血管内皮细胞的调节功能目的:虽然绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE免疫调控功能已得到证实,且此免疫活性可能由两个关键肽段Be位点和Fe位点介导[1],然而细胞表面与其结合的分子并不清楚。课题组应用亲和Pull-down技术,初步发现FlgE可与CAV1、ATP synthase、Rab5等细胞膜分子结合[1],然而,缺乏有力的实验数据证明这一推测。近年研究发现细胞膜表面表达的ATP合酶在能量代谢、炎症反应及肿瘤免疫等发面发挥重要作用。本实验以HUVEC和SVEC细胞系为模型,探讨其表面的ATP5B在FlgE识别及调节血管内皮细胞生物学功能中的作用。方法:制备ATP5B蛋白的兔源性多克隆抗体(Pc ATP5BAb)流式检测HUVEC和SVEC细胞膜表面ATP5B蛋白的表达。提取内皮细胞(ECs)胞膜蛋白,采用亲和Pull-down技术检测FlgE和FlgEM与ATP5B蛋白的结合。流式及ELISA法检测FlgE、FlgEM、B肽段、F肽段与内皮细胞膜表面ATP5B蛋白或重组ATP5B蛋白的结合,Luminescence法检测此过程中ECs表面ATP合酶活性的变化情况。通过细胞增殖(MTT法)、细胞迁移(细胞划痕实验)、细胞凋亡(Annexin V-7AAD)、细胞通透性(FITC-Dextran)等实验检测FlgE的刺激活性及细胞膜表面ATP5B蛋白经抗体、B肽段或F肽段阻断后对FlgE刺激活性的影响。q PCR和western blot方法检测相关基因或蛋白的变化。结果:流式方法检测到HUVEC和SVEC细胞膜表面有ATP5B蛋白的表达,且ATP5B蛋白表达量与细胞的增值状态相关。Pull-down结果可见FlgE,而不是FlgEM,与ECs细胞膜ATP5B蛋白结合。流式与ELISA检测发现虽然FlgEM亦可与ECs结合但其结合能力远远低于FlgEM、Be短肽及Fe短肽,且后三者与ecto-ATP5B的结合可被Pc ATP5BAb特异性抑制。Be短肽及Fe短肽与重组ATP5B蛋白或ECs表面ATP5B蛋白的结合可被FlgE或Pc ATP5BAb竞争性抑制。此外,Be短肽和Fe短肽还具有与Pc ATP5BAb相似的功能,与ECs细胞膜表面ATP5B亚基结合后能抑制其催化ADP转化为ATP的活性,有趣的是,FlgE和FlgEM对ATP合酶活性影响不大。FlgE刺激可引起HUVEC和SVEC增殖减弱、迁移增加、凋亡增加、通透性增强等现象,而当HUVEC和SVEC细胞经Pc ATP5BAb封闭后可显著减弱FlgE刺激引起的以上效应。结论:重组FlgE蛋白通过Be和Fe位点与内皮细胞膜表面的ATP5B蛋白结合从而介导内皮细胞的一系列炎性改变。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378
【图文】：

模式图,蛋白A,模式图,琼脂糖凝胶电泳

图 1 FlgE 蛋白A）pET24-FlgE 质粒模式图；B）FlgE 蛋白琼脂糖凝胶电泳图；3.2 FlgE 诱导 ALI 的一般检测指标FlgE 滴鼻 24 h 后，经眶静脉采血检测外周血象发现与正常对照组小鼠相比 F

中淋巴细胞,检测指标,白细胞,小鼠

FlgE 滴鼻 24 h 后，经眶静脉采血检测外周血象发现与正常对照组小鼠相比 FlgE滴鼻后外周血白细胞总数升高；进一步对白细胞亚群进行分析，发现增加的细胞主要为中性粒细胞（图2A，B）。qPCR及 ELISA检测结果显示小鼠肺组织及 BALF中IL-1b、IL-6、IL-17A 表达水平升高（图 2C，D）。HE 病理切片显示 FlgE 滴鼻 24 h 后肺组织中有大量炎性细胞浸润（图 2E）。以上结果说明细菌鞭毛钩蛋白 FlgE 可作为独立的细菌成分引起小鼠急性肺损伤。

炎性因子,中性粒细胞,特异性抗体,小鼠

图 3：FlgE 诱导 ALI 肺组织中炎性细胞浸润情况及相关炎性因子表达水平小鼠中性粒细胞消除组，在 FlgE 滴鼻之前 24 h 预先经腹腔注射 150 g/500nti-Ly6G/C 特异性抗体。A）FlgE 滴鼻 24 h 后用 1 mL PBS 灌洗小鼠肺组织获得支肺泡灌洗液，并计数浸润的细胞数。根据细胞的特异膜表面分子标记免疫细胞

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