成骨细胞敲除Fbxw7基因小鼠的构建与表型鉴定
发布时间：2020-07-28 08:14
【摘要】：成骨细胞是骨组织中重要组分,在骨骼发育过程中分化产生骨基质,负责骨基质的合成、分泌和矿化。它将特定的骨钙蛋白,碱性磷酸酶和I型胶原分泌到细胞外基质中,形成具有支撑功能的骨的最重要部分。成骨细胞上的缺陷会导致骨疾病的发生,通过靶向成骨细胞会促进骨形成,能加速骨结构与功能性疾病的修复,所以成骨细胞在骨组织中发挥着重要的作用。Fbxw7是SCF(Skp-Cullin-F-box)泛素连接酶E3复合物中底物特异性识别的关键因子,控制细胞中大多数蛋白质的降解。研究表明:Fbxw7可通过骨中的内皮细胞Notch MiR-497-195簇靶向Fbxw7和P4HTM,进而影响CD31hi Emcnhi骨内皮细胞中的Notch,从而调节血管跟骨组织,这提示我们Fbxw7与骨组织之间有重要联系。泛素化因子通常被广泛报道用于肿瘤研究中,可泛素化在骨骼发育和骨代谢平衡也发挥着重要的作用,泛素连接酶的功能障碍与骨疾病的发展密切相关。有实验证明:Smurfl,一种HECT类型的泛素连接酶,是重要的骨形成负调控因子,它的高表达会引起骨量下降。这提示泛素化因子与骨代谢有关联。骨代谢过程包括骨吸收与骨形成,合成骨基质的成骨细胞是骨组织不可或缺的组分,在骨代谢中起着重要的作用。Fbxw7是泛素化的重要因子,部分泛素化因子会影响骨代谢。但是,目前尚无确切研究证明Fbxw7基因是否会参与骨代谢,也无研究报道成骨细胞中Fbxw7基因对骨代谢的的作用。因此本研究旨在通过Cre-Loxp系统构建成骨细胞(Bglap)敲除Fbxw7基因的转基因小鼠模型验证:Fbxw7基因是否参与了骨代谢,如果参与了骨代谢,Fbxw7基因在成骨细胞中发挥着怎样的作用。探究Fbxw究对细胞和动物体内的成骨细胞、破骨细胞、相关物质的影响,为骨疾病的防治提供新的依据。本实验应用Cre-Loxp系统构建成骨细胞(bglap)中敲除Fbxw7基因的转基因小鼠,通过PCR、western blot、免疫组织化学验证转基因小鼠的敲除效果。然后通过HE染色、Mirco-CT分析Fbxw7基因对小鼠骨组织形态、结构的影响。通过Trap染色、Ocn染色、ALP染色分析成骨细胞中Fbxw7基因对小鼠骨组织成分的影响。另外通过QPCR、western blot、免疫组织化学,探究成骨细胞中Fbxw7基因对小鼠骨组织中的蛋白通路的影响。通过以上实验方法论证:Fbxw7基因是否参与了骨代谢过程。由于成骨细胞是成熟个体中骨髓造血微环境的关键构成成分,成骨细胞功能的变化与多种血液相关疾病有关联,因此本课题还通过流式细胞仪、血常规仪观察Bglap-Fbxw7小鼠的造血功能。主要实验结果如下:1、Fbxw7基因参与了骨代谢过程。2、成骨细胞敲除Fbxw7基因后,小鼠体重、体长无变化,但敲除组小鼠骨小梁数量,骨小梁厚度数值显著上升。3、成骨细胞敲除Fbxw7基因后,成骨细胞数量增多。4、成骨细胞敲除Fbxw7基因后,使PCNA蛋白上升、Runx2蛋白下降,成骨细胞增殖增多,成骨细胞分化减少。综上所述,我们研究表明:Fbxw7基因参与了骨代谢,成骨细胞中敲除Fbxw7基因,会使小鼠骨小梁数量,骨小梁厚度数值升高,成骨细胞增殖增加,成骨细胞分化减少,成骨细胞数目增加。提示在今后骨疾病防治中,Fbxw7基因可能是一个潜在靶点。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2
【图文】：
我们通过ＰＣＲ、ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ、免疫组化三方面来验证。逡逑我们剪取１５天龄的小鼠鼠尾，鼠尾裂解液裂解，通过ＰＣＲ检测显示条带逡逑ｂｐ大小符合Ｊａｃｋｓｏｎ实验室的ｐｒｏｔｏｃｏｌ邋（如图２Ａ所示）。逡逑在超净台工作台中提取３天龄你小鼠的头盖骨成骨细胞，做原逡逑代培养七天后，用ＳＤＳ裂解液提取蛋白，ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测Ｋ０组小鼠与Ｃｏｎ逡逑组小鼠Ｆｂｘｗ７蛋白含量。发现你转基因小鼠里，成骨细胞中Ｆｂｘｗ７逡逑蛋白表达量降低，验证了敲除效果（如图２Ｂ所示）。逡逑获取四月龄的小鼠的股骨，４％多聚甲醛固定，１４％乙二胺四乙酸脱钙液脱钙，逡逑５邋ｕ邋ｍ切片，通过免疫组化检测验证他＾７转基因小鼠敲除效果，发现Ｃｏｎ逡逑组成骨细胞中Ｆｂｘｗ７蛋白表达量比Ｋ０组增高，验证了敲除效果（紧贴骨小梁扁逡逑平细长、梭型细胞为成骨细胞
否发生变化。我们将一对实验小鼠（Ｋ０小鼠与Ｃｏｎ小鼠）同一笼饲养，待小鼠逡逑为四Ｗ龄大时，州３０厘米标尺，千分位天平，测量、称量小鼠体重体长。经测逡逑量、称量、ＳＰＳＳ２０．邋０独立Ｔ检验发现Ｋ０组、Ｃｏｎ组体重体长无差异（如图３Ｂ逡逑所示）。逡逑２３逡逑
Ｃｏｎ逦Ｋ0逡逑图４．取ｉａｐＴ＾ｘＷ小鼠股骨及胫骨ＨＥ染色图逡逑图Ａ．邋ＨＥ染色股骨端切片图（５Ｘ）。图Ｂ．邋ＨＥ染色胫骨端的切片图（５Ｘ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４．邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｂｏｎｅ邋ｉｎ邋Ｂ｝＊ｌａｐ－Ｆｂｘｗ７邋ｍｉｃｅ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ａ．邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｆｅｍｏｒａｌ邋ｅｎｄ邋ｓｅｃｔｉｏｎ邋（５ｘ）．邋Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｂ．邋ＨＥ－ｓｔａｉｎｅｄ邋ｓｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｈｕｍｅｒｕｓ邋（５ｘ）．逡逑４．邋２邋Ｍｉｃｒｏ—ＣＴ发现敲除组小鼠骨量增加逡逑为了进一步探[偝晒窍赴贸纾蓿范孕∈蠊亲橹挠跋欤婧笪颐腔袼脑铝洌耍靶∈笥耄茫铮钚∈蟮墓晒牵矗ザ嗑奂兹┕潭āⅲ罚担ゾ凭４妫蠼停椋悖颍铮茫陨韫鄄煨∈蠊峭返谋浠ㄍ迹担了荆Ｍü停椋颍悖铮茫陨杓觳猓义希樱校樱渝澹玻埃巴臣品治觯っ髁顺晒窍赴贸伲唬蓿坊颍岬贾滦∈蠓⑸橇垮义显黾拥谋硇停汗切×菏浚ǎ裕颍幔猓澹悖酰欤幔蝈澹危酰恚猓澹颍裕猓澹危⒐切×汉穸龋ǎ裕颍幔猓澹悖酰欤幔蝈义希裕瑁椋悖耄睿澹螅螅澹裕猓裕瑁┫灾撸兄担迹埃埃担哂型臣蒲б庖澹ㄈ缤迹担滤荆ｅ义
本文编号：2772601
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2
【图文】：
我们通过ＰＣＲ、ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ、免疫组化三方面来验证。逡逑我们剪取１５天龄的小鼠鼠尾，鼠尾裂解液裂解，通过ＰＣＲ检测显示条带逡逑ｂｐ大小符合Ｊａｃｋｓｏｎ实验室的ｐｒｏｔｏｃｏｌ邋（如图２Ａ所示）。逡逑在超净台工作台中提取３天龄你小鼠的头盖骨成骨细胞，做原逡逑代培养七天后，用ＳＤＳ裂解液提取蛋白，ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测Ｋ０组小鼠与Ｃｏｎ逡逑组小鼠Ｆｂｘｗ７蛋白含量。发现你转基因小鼠里，成骨细胞中Ｆｂｘｗ７逡逑蛋白表达量降低，验证了敲除效果（如图２Ｂ所示）。逡逑获取四月龄的小鼠的股骨，４％多聚甲醛固定，１４％乙二胺四乙酸脱钙液脱钙，逡逑５邋ｕ邋ｍ切片，通过免疫组化检测验证他＾７转基因小鼠敲除效果，发现Ｃｏｎ逡逑组成骨细胞中Ｆｂｘｗ７蛋白表达量比Ｋ０组增高，验证了敲除效果（紧贴骨小梁扁逡逑平细长、梭型细胞为成骨细胞
否发生变化。我们将一对实验小鼠（Ｋ０小鼠与Ｃｏｎ小鼠）同一笼饲养，待小鼠逡逑为四Ｗ龄大时，州３０厘米标尺，千分位天平，测量、称量小鼠体重体长。经测逡逑量、称量、ＳＰＳＳ２０．邋０独立Ｔ检验发现Ｋ０组、Ｃｏｎ组体重体长无差异（如图３Ｂ逡逑所示）。逡逑２３逡逑
Ｃｏｎ逦Ｋ0逡逑图４．取ｉａｐＴ＾ｘＷ小鼠股骨及胫骨ＨＥ染色图逡逑图Ａ．邋ＨＥ染色股骨端切片图（５Ｘ）。图Ｂ．邋ＨＥ染色胫骨端的切片图（５Ｘ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４．邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｂｏｎｅ邋ｉｎ邋Ｂ｝＊ｌａｐ－Ｆｂｘｗ７邋ｍｉｃｅ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ａ．邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｆｅｍｏｒａｌ邋ｅｎｄ邋ｓｅｃｔｉｏｎ邋（５ｘ）．邋Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｂ．邋ＨＥ－ｓｔａｉｎｅｄ邋ｓｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｈｕｍｅｒｕｓ邋（５ｘ）．逡逑４．邋２邋Ｍｉｃｒｏ—ＣＴ发现敲除组小鼠骨量增加逡逑为了进一步探[偝晒窍赴贸纾蓿范孕∈蠊亲橹挠跋欤婧笪颐腔袼脑铝洌耍靶∈笥耄茫铮钚∈蟮墓晒牵矗ザ嗑奂兹┕潭āⅲ罚担ゾ凭４妫蠼停椋悖颍铮茫陨韫鄄煨∈蠊峭返谋浠ㄍ迹担了荆Ｍü停椋颍悖铮茫陨杓觳猓义希樱校樱渝澹玻埃巴臣品治觯っ髁顺晒窍赴贸伲唬蓿坊颍岬贾滦∈蠓⑸橇垮义显黾拥谋硇停汗切×菏浚ǎ裕颍幔猓澹悖酰欤幔蝈澹危酰恚猓澹颍裕猓澹危⒐切×汉穸龋ǎ裕颍幔猓澹悖酰欤幔蝈义希裕瑁椋悖耄睿澹螅螅澹裕猓裕瑁┫灾撸兄担迹埃埃担哂型臣蒲б庖澹ㄈ缤迹担滤荆ｅ义
本文编号：2772601
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