沙眼衣原体假定功能蛋白CT036的定位及磷酸化蛋白质组学分析

发布时间：2020-07-29 16:57

【摘要】：目的沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是革兰染色阴性的特殊细菌,感染细胞后能在宿主细胞的胞浆内形成包涵体,并通过包涵体膜从宿主细胞获取营养物质以完成自身的发育周期。CT036蛋白是Ct基因组编码的假定功能蛋白,计算机软件预测显示其可能定位于包涵体膜,但其具体定位及生物学功能还不清楚。本实验采用原核表达载体构建了pET28a-ct036的重组表达质粒,在大肠杆菌中诱导His-CT036重组蛋白的表达并进行纯化,免疫小鼠后制备多克隆抗体,对沙眼衣原体感染宿主细胞后CT036蛋白的表达进行定位;同时,构建了CT036慢病毒载体和对照载体,感染HeLa细胞制备CT036基因稳定过表达细胞系与对照细胞系,并利用磷酸化蛋白质组学技术分析了CT036细胞内表达可能影响的细胞通路及生物学功能;最后采用Western Blot和流式细胞术等对蛋白质组学筛查结果进行了初步验证。该研究为揭示沙眼衣原体CT036蛋白的定位及功能提供了重要的实验数据,也为进一步深入研究沙眼衣原体的致病机制奠定了基础。方法1.依据GenBank中CT036的基因序列设计特异性PCR引物,以Ct D型基因组为模板进行PCR扩增CT036基因。构建表达重组质粒pET28a-ct036,鉴定正确后转化大肠杆菌,使用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot鉴定,用His-琼脂糖树脂纯化重组蛋白,BCA法检测重组蛋白浓度。2.用纯化的pET28a-ct036重组蛋白免疫BALB/c小鼠,使用间接ELISA法检测免疫鼠的多克隆抗体效价,Western blot检测抗体的特异性。3.Ct D型感染HeLa细胞,以兔抗衣原体菌体及鼠抗CT036蛋白为一抗,间接免疫荧光法检测CT036蛋白在衣原体感染细胞的定位。4.构建CT036慢病毒表达载体,与辅助包装原件载体共同包装慢病毒并测定慢病毒滴度,随后用CT036慢病毒与Flag标签对照慢病毒感染HeLa细胞。Western blotting检测CT036蛋白的表达。5.使用磷酸化iTRAQ相对定量蛋白质组学鉴定CT036-HeLa稳转细胞组与对照组的差异磷酸化蛋白。Motif-x软件对鉴定到的所有磷酸化修饰位点进行保守motif分析;对差异表达磷酸化肽段对应的蛋白进行筛选,使用GO、KEGG等生物信息学工具分析,筛选获得CT036胞内表达主要影响的磷酸化蛋白以及细胞通路和功能并进行体外验证。6.将CT036蛋白稳转细胞与慢病毒感染对照细胞进行Hoechst染色,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,WB检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平。7.将CT036-HeLa稳转细胞,对照组细胞与PI3K抑制剂处理过的CT036-HeLa稳转细胞经TNF-α(20ng/ml)与CHX(2μg/ml)诱导凋亡6h后,使用Hoechst染色,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,WB检测GSK 3β蛋白的磷酸化水平,WB检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平。结果1.成功扩增目的基因片段与重组表达质粒载体pET28a-ct036,IPTG诱导表达后His-琼脂糖树脂纯化出高浓度的His-CT036重组蛋白。2.pET28a-ct036重组蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫4次后产生高效价抗体,经ELISA与WB检测多克隆抗体能识别His-CT036重组蛋白,且效价≥1:52000。3.IFA结果显示假定功能蛋白CT036在感染细胞中的分布与已知的包涵体膜蛋白IncA的分布一致,表明CT036蛋白定位于衣原体感染细胞的包涵体膜。4.成功构建了CT036慢病毒表达载体,慢病毒包装完成后,测定慢病毒滴度较高,CT036慢病毒与Flag标签对照慢病毒感染HeLa细胞获得了相应的稳定过表达细胞系,倒置荧光显微镜观察有明亮的绿色荧光,Western blot检测有目的条带。5.磷酸化iTRAQ相对定量蛋白质组学鉴定CT036-HeLa稳转细胞组与对照组的差异磷酸化蛋白,共鉴定到磷酸化蛋白质3001个、磷酸化肽段7668个。按照表达倍数变化1.2倍以上且P value0.05的标准筛选得到388个差异表达磷酸化肽段,对应301个蛋白。对这些蛋白进行GO功能富集,可知CT036蛋白主要参与调控了细胞周期、细胞凋亡、免疫进程、囊泡运输等多种生物学过程。将筛选得到的53个参与调亡过程的蛋白和KEGG通路分析富集到的与凋亡相关的PI3K、mTOR、Chemokine等信号通路的蛋白取交集,结果发现GSK3β参与多条信号通路。WB检测结果显示CT036蛋白内源性表达组与对照组相比GSK3β蛋白磷酸化水平明显上升。6.Hoechst染色结果显示:CT036-HeLa稳转细胞组凋亡率较阳性对照组降低4.27%(P0.001);流式细胞仪检测结果显示:CT036-HeLa稳转细胞组凋亡率较阳性对照组降低4.58%(P0.001)。WB检测结果显示CT036-HeLa稳转细胞组与对照组相比Bax表达明显下调,Bcl-2表达明显上调。7.经诱导凋亡处理后,Hoechst染色结果显示:CT036-HeLa稳转细胞组凋亡率较阳性对照组降低21.57%(P0.0001),较CT036-HeLa稳转细胞的PI3K抑制剂处理组降低23.47%(P0.0001);流式细胞仪检测结果显示:CT036-HeLa稳转细胞组凋亡率较阳性对照组降低21.19%(P0.0001),较CT036-HeLa稳转细胞的PI3K抑制剂处理组降低21.84%(P0.0001);WB检测结果显示CT036-HeLa稳转细胞组与对照组相比GSK 3β发生明显磷酸化,Bax表达明显下调,Bcl-2表达明显上调,与CT036-HeLa稳转细胞的PI3K抑制剂处理组相比GSK3β发生明显磷酸化,Bax表达明显下调,Bcl-2表达明显上调。结论1.沙眼衣原体假定功能蛋白CT036定位于衣原体感染细胞的包涵体膜。2.CT036的细胞内表达影响的差异磷酸化肽段所对应的301个蛋白质与衣原体感染相关的主要功能可能有调控细胞周期、细胞凋亡、免疫进程、囊泡运输及内吞等。3.CT036可能通过促进PI3K-Akt信号通路的GSK3β蛋白磷酸化而抑制细胞凋亡。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R374
【图文】：

图 4.1 CT0366 基因的 PCR 电泳图Fig. 4.1 PCR electropherogram of ct036 geneM：DNA Marke;1;: PCR amplification product of ct0.1.2 重组基因表达菌 PCR 扩增结果

图 4.2 PCR 扩增 CT036 转化 E.coli BL2 菌的电泳结果Fig. 4.2 PCR electropherogram of CT036 transformed E.coli BL21 strainsM：DNA Marker；1-5：BL21 PCR amplification results

图 4.4 CT036 重组蛋白的纯化Fig. 4.4 Purification map of CT036 recombinant proteinM：Protein marker；FT：Flow through；1-3：Washes；4-6：Elutions 动物免疫重组蛋白与重组蛋白的鉴定.1 重组蛋白免疫小鼠血清抗体效价分析以 450nm 相对吸光度值＞2.1 为阳性反应。结果表明重组蛋白能够刺激小免疫反应，第四次免疫后血清抗体滴度≥1：52000。.2.重组蛋白 Western Blot 鉴定

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