肺炎支原体生物膜形成分析及特性研究

发布时间：2020-08-06 11:06

【摘要】：研究背景及目的:肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,M.pneumoniae)是学龄期和学龄前期儿童社区获得性肺炎中最重要的病原体之一。目前已发现多种支原体存在与感染密切相关的生物膜结构,而M.pneumoniae在这个方面尚处于基础理论研究阶段。完善M.pneumoniae生物膜形成理论及探索其功能对进一步了解M.pneumoniae感染机制有十分重要的意义。方法:1.通过结晶紫染液微孔法和玻片法验证M.pneumoniae是否具有在非生命物质表面粘附聚集能力;2.通过培养法结合超声波震荡技术破坏生物膜结构并检测其中活菌数。绘制P1-1型标准株M129,P1-2型标准株FH游离和生物膜中M.pneumoniae生长曲线及同步在扫描电子显微镜下观察M.pneumoniae生物膜形成过程;3.通过临床采样分离获得M.pneumoniae临床耐药菌株,同时对其采用双序列PCR验证,23SrRNAV区耐大环内酯类耐药突变测序,多位点短阵重复序列分型,体外药敏试验确定其相关抗生素最小抑菌浓度;4.对P1-1型标准株M129,P1-2型标准株FH及临床耐药株Strain 9形成的生物膜,检测其在不同浓度的阿奇霉素影响下对M.pneumoniae的保护功能,同时对比不同阶段的M.pneumoniae生物膜功能强弱;5.通过50℃,不同时长的加热评估M.pneumoniae生物膜对其抵御高温的影响。结果:1.通过玻片法和微孔法发现,存在具有活性的M.pneumoniae可使玻片和聚苯乙烯经结晶紫染色后吸光度值明显增高(M129组、FH组vs死菌组、肉汤培养基组:玻片 0.798±0.148、0.807±0.129 vs 0.403±0.058、0.415±0.034;聚苯乙烯 0.284±0.041、0.288±0.025vs0.240±0.033、0.245±0.030;p均0.05),且两种方法中 M129组和FH组间无显著差异(t分别为-0.085,0.-226,对应p为0.936,0.825);死菌组和肉汤培养基组间也无显著性差异(两组t=-0.293,t=0.-152,p分别为0.784,0.882);2.扫描电子显微镜下对比超声波震荡处理与否的玻片可见大量M.pneumoniae聚集形成的数百层“塔”样结构经超声波震荡处理后仅余数层松散结构。M.pneumoniae在37℃,5%CO2环境中生长繁殖呈“S”型曲线,无论游离状态还是在生物膜中,都在96h～120h间达到浓度高峰,随后迅速下降,游离状态在168h,生物膜状态在192h时全部死亡。整个过程中生物膜形态随时间变化,有粘附,成熟,消散阶段,M.pneumoniae单体构成M.pneumoniae生物膜主体,且P1-1型标准株M129和P1-2型标准株FH的形成过程形态存在差异;3.分离到94株来自门诊和13株来自学区的M.pneumoniae临床菌株,选取其中的Strain 9作为临床耐药株代表,测得菌株为P1分型1型,MLVA分型为U型(5/4/5/7/2),耐药位点测序显示为23SrRNAV区2063A→G突变,体外药敏实验显示其对除麦迪霉素外大环内酯类高度耐药(红霉素、克拉霉素、阿奇霉素MIC均256μg/ml,麦迪霉素 MIC=64μg/ml);4.在早期生物膜72h状态组中,游离M.pneumoniae和生物膜中M.pneumoniae均受到1×MIC～4×MIC浓度的阿奇霉素影响而随时间活菌数越来越少,其中2×MIC～4×MIC组中在最终96h时均无法检测到活菌,无论游离状态M.pneumoniae还是生物膜中的M.pneumoniae,两者在各浓度各时段下降速度未有显著性差异(p均0.05)。在晚期生物膜168h状态组中,同样游离M.pneumoniae和生物膜中M.pneuoniae均受到1×MIC～4×MIC浓度的阿奇霉素影响而随时间活菌数越来越少,但在Oh～48h间,游离状态活菌下降速度显著快于生物膜中(0h～24h:-0.52±0.20 vs-0.14±0.09,p=0.040;-1.27±0.19 vs-0.34±0.25,p=0.007;-1.43±0.05 vs-0.98±0.05,p0.001)(24h～48h:-0.53±0.10 vs-0.27±0.08,p=0.021;-1.01±0.18 vs-0.72±0.06,p=0.055;-1.43±0.40vs-0.55±0.10,p=0.021)。生存时间上,在 1×MIC浓度下,游离状态M.pneuoniae存活不足96h,而生物膜中M.pneumoniae则存活至96h以后,在2×MIC浓度下,游离状态存活不足72h,而生物膜中M.pneumoniae则存活至72h～96h之间,在4×MIC浓度下,两者均未存活至72h。5.无论是游离状态,还是生物膜中的M.pneumoniae,在50℃,持续10min的加热下,活菌数没有明显变化(p均0.05)。当连续加热时间达到20min时,无论是游离还是生物膜中的M.pneumoniae都会明显失活,存活比例为1/104.01±0.18 vs 1/102.67+0.14,具有显著性差异(t=10.116,p=0.001)。而降温后再次进行同样加热时,其存活率开始增高1/101.95±0.17 vs 1/101.49±0.14,仍具有显著性差异(t=3.615,p=0.022)。当连续加热时间达到30min时,大部分游离和生物膜中的M。pneumoniae都会死亡,存活比例 1/105.72±0.10 vs 1/105.87±0.31,未及显著性差异(t=-0.407,p=0.721)。当连续加热时间达到40min时,M.pneumoniae无论是游离状态,还是藏躲于生物膜,都无菌存活。结论:1.在适宜条件下,M.pneumoniae可以在玻片表面形成生物膜,且形态随时间和环境变化,且P1-1型标准株M129和P1-2型标准株FH的形成过程形态存在差异;2.M.pneumoniae生物膜由M.pneumoniae菌体而非胞外基质构成其主体,有别于常见的细菌等微生物;3.M.pneumoniae生物膜对M.pneumoniae保护有限,仅能在抗生素浓度较低、高温持续时间较短时延长其中M.pneumoniae生存时间。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R375.2
【图文】：

表１．４邋ＦＨ菌株游离Ｍ逦及生物膜中Ｍ／ｗｅｗ７ｗｏｍ＿ａｅ数量逡逑培养时间（ｈ）游离邋Ｍ．邋ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ邋（１０ｘ／ｍｌ）生物膜中邋Ｍ邋／ｗｅｗｗｃｗ／ｆｉｒｅ邋（１０ｘ／ｃｍ２）＊逡逑０逦４．７４±０．０６逦０逡逑２４逦５．３７±０．１２逦４．４７±０．１５逡逑４８逦６．５４±０．２６逦６．４７±０．４８逡逑７２逦７．３４±０．３９逦７．３０士邋０．６８逡逑９６逦８．２１±０．１９逦９．２５±０．０７逡逑１２０逦８．５１±０．４８逦９．３９±０．０５逡逑１４４逦７．８５±１．１３逦８．１１±0．２５逡逑１６８逦３．５９±０．４２逦３．７９±０．６９逡逑

３．３扫描电子显微镜下生物膜形成过程逡逑图１．３至图Ｕ３展现了生物膜从形成到消亡的全过程。从中可以发现，Ｍ逡逑／ｗｅｗｍｏｎ／ｗ生物膜的形成的步骤类似于细菌，都起源于粘附，从２４ｈ开始，以单逡逑体的形态散在粘附于坡片的表面，此时Ｍ１２９和ＦＨ并无明显差异（图１．３）。逡逑至４８ｈ时，Ｍ／ｗｅｗｗｏｍ’ｏｅ开始聚集成团，形成数层形状不一的空间结构，此逡逑时Ｍ１２９与ＦＨ开始出现差异，前者以球型的单体聚集为主，而后者在形成生物膜逡逑过程中，个体的形态发生了明显的变化。聚团的单体开始变得细长弯曲，其中一逡逑段膨大，呈“蝌蚪”样，相互交联紧密，形成多层的空间结构，结构外仍紧贴坡逡逑片的单体形态又有所不同，同样细长但主体却更为挺直，弯曲呈折角，类似于“竹逡逑枝”样，相互之间交联成网状（图１．４）。逡逑

逦第一部分实验结果逡逑步增高，出现类似Ｍ１２９中的表面物质（图１．６）。同时从放大１０００倍的图像中可逡逑以得见由中央向周围辐散的结构形态。Ｍ１２９呈中央密集向周围圆形辐散的特点，逡逑密度随中央向周围逐渐减弱至消失，存在边界。而ＦＨ则除中央结构外，底层向外逡逑辐散成网状，覆盖整个底面（图１．７）。逡逑在１２０ｈ左右，尽管Ｍ／ｗｅｗ／Ｍｏｍ＇ａｅ生物膜中活菌数检测达到最高，但部分位逡逑置已经开始出现破坏降级现象。Ｍ１２９中聚集形成的结构开始不再保持一致以来圆逡逑柱状形态，表现出类似最初的多种形态，单体也从球型逐渐变为椭圆等类球型状逡逑态，少数单体破损严重，仅残留少量膜状物质。ＦＨ较前变化不明显，周身的表面逡逑覆盖物质也增多，单体形态较前变化不明显（图１．８）。逡逑临近１４４ｈ时

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