神经元特异性形式AP3调控GABA能突触中ADBE囊泡再生功能及机制研究

发布时间：2020-08-06 13:56

【摘要】：中枢神经系统的功能依赖于突触囊泡进行胞吐释放神经递质。为了维持突触传递效率,突触前膜需要经过回收,突触囊泡在突触末梢再生。关于突触囊泡膜回收的模式主要有四种:(1)“kiss-and-run”内吞,(2)超快速内吞(ultrafast endocytosis),(3)网格蛋白介导内吞(clathrin-mediated endocytosis,CME)和活性依赖大容量内吞(activity-dependent bulk endocytosis,ADBE)。这些内吞模式启动的速度、参与的分子组成及对突触囊泡性质的维持各不相同。谷氨酸能突触和GABA能突触作为中枢中最主要的兴奋性突触和抑制性突触,它们在突触前囊泡循环模式及囊泡形态上有没有差别?这些差异对其功能又有怎么样的影响?为了探究两者在突触前功能上的差异,本文采用冷冻三维重构和辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)内吞标记物示踪的方法,发现兴奋性突触前囊泡形态学比较均一,囊泡直径集中在60nm;而抑制性突触突触前囊泡形态差异比较大,含有很多直径在80nm的内吞体样囊泡,并且这种囊泡形态上的差异和它们启动的不同内吞模式及囊泡循环方式息息相关,谷氨酸能突触直接以单个经典大小的,均一化囊泡回收方式进行囊泡循环,而GABA能突触更倾向于采用内吞体作为中转站重新出芽再生,形成新的突触囊泡对囊泡池进行补充。为了深入探究GABA能突触内吞体再生途径中重要介导分子,本文通过流式分选和蛋白质谱分析相结合,对GAD阳性神经元和阴性神经元差异性蛋白进行分析,发现神经元特异性衔接蛋白AP3B2在抑制性神经元中富集,并以更高比例定位到抑制性突触末梢,参与调控GABA能突触中内吞体出芽形成囊泡的过程;AP3B2功能缺陷会导致GABA能突触末梢堆积大量内吞体样结构的大囊泡(ELV),而经典突触囊泡(SVS/SVM)数量显著减少;AP3B2缺陷导致分选到GABA能突触部位的标志性蛋白含量显著下降,但谷氨酸能突触末梢囊泡形态和蛋白表达含量均不受影响。同时,AP3B2敲除小鼠表现出过度活跃的特点和癫痫易感性增加等神经系统异常的行为学表征。本研究实验结果说明:1、谷氨酸能突触和GABA能突触囊泡形态的差异和它们囊泡循环模式息息相关;2、衔接蛋白AP3B2参与调控抑制性GABA能突触上内吞体出芽再生形成新的突触囊泡的过程;3、AP3B2可能对抑制性蛋白分拣起关键作用;4、GABA能突触内吞体途径囊泡再生障碍可能是Ap3b2--小鼠神经系统异常的新机制。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R338
【图文】：

浙江大学博士学位论文逦实验结果逡逑突触囊泡偏向更扁平或者不圆（图ＩＤ，邋１Ｅ）。通过对囊泡直径和圆度两个参数进逡逑行线性关系分析发现，海马脑片中ＧＡＢＡ能突触囊泡直径越大，囊泡圆度变小，逡逑即囊泡更扁平，囊泡直径和圆度呈现负相关（图ＩＦ，邋１Ｇ）。上述结果说明谷氨酸逡逑能突触和ＧＡＢＡ能突触突触前囊泡呈现不同直径大小和不同形态分布的特征，逡逑ＧＡＢＡ能突触前大囊泡比例更高，而且形状趋向于扁平状。逡逑Ａ邋｜逦Ｓｌｉｃｃｒ邋（ＸＹ）邋￣［Ｉ邋３Ｄ邋Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋（ＸＹＺ）邋｜邋Ｂ逦ＦＦ－ｃｒｙｏ－ＥＴ逦ＨＰＦ／ＦＳ－ＥＴ逡逑

实验结果逡逑本研究在对海马脑片进行扫描透射电子显微镜电子断层扫描重构（ＳＴＥＭ－ＥＴ）逡逑（图２Ａ）和高压冷冻及冷冻替代重构（ＨＰＦ／ＦＳ－ＥＴ）（图２Ｂ）也发现兴奋性突触逡逑前的囊泡在形态上都比较均一，同质性很高；而抑制性突触末梢含有在直径和大逡逑小形态上都呈现多样化的囊泡，异质性更显著的特点。逡逑Ａ邋｜邋ＳＴＥＭ邋－邋ＸＹ邋Ｓｌｉｃｅｒ邋｜｜逦３Ｄ邋ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ￣｜邋Ｂ邋｜逦ＦＩＢ邋－邋ＸＹ邋Ｓｌｉｃｅｒ逦｜｜逦３Ｄ邋ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ逡逑■杴＿＿逡逑丨：逡逑图２海马脑片ＧＡＢＡ能和谷氨酸能突触超微结构电镜三维重构（与图１匹配）逡逑（Ａ）逦ＧＡＢＡ能（上）和谷氨酸能（下）突触ＳＴＥＭ－ＥＴ电镜三维重构中ＸＹ平面逡逑截图（左上图、左下图）和三维重构渲染图（右上图、右下图）。三维重构通过逡逑ｉＭＯＤ软件勾勒突触具体形态，绿色代表突触前膜，蓝色代表突触后膜；粉色代表逡逑直径小于４０邋ｎｍ小囊泡（ＳＶＳ）和直径在４０邋ｎｍ－６０邋ｎｍ之间中等大小囊泡（ＳＶＭ）；逡逑深蓝色代表直径在６０ｎｍ－８０ｎｍ之间的大囊泡（ＳＶＬ）；红色代表直径在８０ｎｍ－１００逡逑ｎｍ之间的囊泡（ＥＬＶ）；黄色代表直径大于１００ｎｍ的囊泡（ＥＬＶ）。比例尺２００逡逑ｎｍ0逡逑（Ｂ）

（Ａ）通过电场刺激（ＥＦ－Ｓ）或高钾（ＫＣＩ－Ｓ）刺激海马神经元内吞辣根过氧化物逡逑酶（ＨＲＰ）示意流程图。海马神经元用细胞外液（ＥＣＳ）配制的ＨＲＰ邋（丨０ｍｇ／ｍＬ）逡逑进行预孵育，３７°Ｃ邋５分钟；随后用４０邋Ｈｚ，邋２００邋ＡＰｓ电场剌激，冰上预冷的细胞外逡逑液迅速涮洗即刻固定（０分钟），其他时间点的剌激在细胞外液中，３７°Ｃ细胞培养逡逑２９逡逑

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本文编号：2782496