基于微流控技术的高通量细胞迁移方法学研究

发布时间：2020-08-06 14:14

【摘要】：[目的]血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的迁移与动脉粥样硬化导致的动脉狭窄闭塞和血管腔内治疗术后再狭窄的病理进程息息相关,因此对于VSMC迁移的研究便显得尤为重要。传统的细胞学迁移实验方法通量低,实验一致性较差,可重复性差,存在较大的局限性,制约了 VSMC的迁移表征,同时也降低了对VSMC迁移研究的可信证据级别。因此,本实验基于微流控技术,设计3种高通量细胞划痕迁移芯片,研究细胞迁移的新方法,提高实验通量的同时,克服实验一致性差及实验可控性差的缺点,同时对细胞芯片进行可行性验证,力争为VSMC的迁移寻求准确的实验方法,后续为VSMC的迁移提供可靠的实验数据,进而为VSMC的迁移相关性疾病的防治开拓新的思路及方案。[方法]1.基于微流控技术设计3种不同的高通量细胞迁移方法,即二维细胞加电去硫醇的迁移方法、三维细胞胶原覆盖硫醇的迁移方法和二维细胞胶原覆盖硫醇的迁移方法;针对不同的方法,设计相应类型的迁移芯片。2.验证芯片的可行性,是否可以准确表征细胞的迁移。在芯片中接种肿瘤细胞:人肺癌细胞系(A549、H1299)和人宫颈癌细胞系(HeLa),观察肿瘤细胞在芯片中的接种、生长及迁移,并施以不同的细胞刺激因子:胎牛血清(fetalcalfserum,FBS)和趋化因子CXCL12。3.利用显微镜及正置激光共聚焦显微镜对细胞迁移前后的情况进行拍照,在Image Pro Plus 6.0中进行图像处理,并在Lab View中进行细胞计数,实验结果用均值±标准差表示,多组间均数比较采用ANOVA检验,检验水准为P0.05(或0.01)代表组间差异有统计学意义(或高度统计学意义)。并利用迁移曲线直观表征迁移情况。4.通过实验结果分析不同芯片的优劣,进一步施以改进。5.对VSMC的迁移进行初步研究。[结果]1.3种迁移芯片制作工艺流程明确、成熟。2.肿瘤细胞及VSMC在高通量迁移芯片中接种后,均能铺满迁移芯片,在迁移芯片中生长状态良好,并可以在芯片中进行迁移。3.3种不同的迁移方法结果表明,1)二维细胞加电去硫醇的迁移方法中,肿瘤细胞可以进行迁移。但是,由于此芯片结构较复杂,加电稳定性差,在进行细胞培养及去除硫醇时存在一定难度,迁移结果一致性较差;2)三维细胞胶原覆盖硫醇的迁移方法中,细胞培养至三维状态需要时间较长,硫醇与金表面的附着能力下降,修饰效果随之下降,金表面出现细胞残留,后续迁移结果存在一定的误差;3)二维细胞胶原覆盖硫醇的迁移方法中,迁移结果一致性较好,结果可信度高,肿瘤细胞及VSMC均可以进行迁移。4.在二维细胞胶原覆盖硫醇的迁移方法中,施以不同的细胞刺激物,结果表明,1)H1299细胞在FBS及CXCL12趋化因子中,表现出不同的迁移状态;HaLe细胞在FBS中迁移状态不同于H1299;2)不同FBS百分比及不同CXCL12浓度对H1299迁移有不同的刺激作用,不同FBS百分比对HaLe细胞有不同的刺激作用;3)VSMC在此芯片中迁移一致性好。[结论]1.高通量细胞迁移芯片设计合理,工艺流程稳定。2.高通量细胞迁移方法实验一致性好,实验结果可信度较高。3.3种芯片均可实现细胞的培养、生长及迁移;经验证,二维细胞胶原覆盖硫醇的迁移方法受其他实验条件变化的影响更小,稳定性好,实验一致性较好。4.二维细胞胶原覆盖硫醇的迁移方法更适用于VSMC的迁移研究。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：

解放军医学院博士学位论文ＭＳ阳模，抽真空，并烘烤（ｂ）；烘烤后进行ＰＤＭＳ翻模（ｃ）；将Ｐ寸进行切割，并进行打孔，便得到９６个通孔的ＰＤＭＳ迁移小室（ｄ预聚物和固化剂的配比时，一定严格按比例进行配比，尤其是固化致ＰＤＭＳ硬度发生变化，影响后续的键和过程。浇注ＰＤＭＳ阳模抽至完全没有气泡，若残存气泡无法抽净，可用吹尘球轻轻吹破气理时，操作应轻柔，多次反复进行翻模，用力不均或用力太大可能导致相邻两个迁移小孔联通。另外，ＰＤＭＳ制备后应尽快使用，否使ＰＤＭＳ变形，在与金结构表面进行键和时导致位置不准确。逡逑ａｂ

图１－３金基底的制备逡逑１．４．３芯片组装逡逑图１－４展示了芯片的组装过程。将Ｈ３ＭＳ和金基底同时放入Ｐｌａｓｍａ邋Ｃｌｅａｎｅｒ逡逑中进行处理（ａ）；取出后将ＰＤＭＳ通孔与金基底的金结构逦对准，快速进行键和逡逑（ｂ）

４０邋ｍｍ逦＾ＡＯｍｒｎ＾逡逑图１－３金基底的制备逡逑１．４．３芯片组装逡逑图１－４展示了芯片的组装过程。将Ｈ３ＭＳ和金基底同时放入Ｐｌａｓｍａ邋Ｃｌｅａｎｅｒ逡逑中进行处理（ａ）；取出后将ＰＤＭＳ通孔与金基底的金结构逦对准，快速进行键和逡逑（ｂ）

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 贾倩;李彦平;贾进举;刘宏斌;;雷帕霉素药物洗脱支架的早中期安全性及有效性评价[J];解放军医学院学报;2014年01期

本文编号：2782518