泛素交联酶RAD6B在UV诱导的DNA损伤修复中作用的研究

发布时间：2020-08-06 21:36

【摘要】：目的:日光中的紫外线(UV)是造成机体DNA损伤的常见因素。正常细胞DNA损伤后会启动DNA损伤修复系统对损伤进行修复,如果损伤能够及时修复,细胞内的DNA结构恢复,继续正常复制。如果损伤不能够修复,细胞有可能会走向凋亡、衰老、突变甚至癌变。RAD6B是一种泛素交联酶E2,在DNA损伤修复及染色质结构和基因表达调控中发挥重要作用。本研究探讨RAD6B在UV诱导的DNA损伤修复中的作用。方法:培养收获处于对数生长期的293T细胞,利用CRISPR/Cas9技术构建RAD6B基因敲除细胞,免疫印迹实验验证RAD6B敲除效果。通过UV诱导DNA损伤。将实验分为四组:sgCON(阴性对照)、sgCON-UV(阴性对照+UV照射)、sgRAD6B(RAD6B敲除)、sgRAD6B-UV(RAD6B敲除+UV照射)。通过免疫荧光观察RAD6B在UV诱导的DNA损伤修复通路中的位置,Western Blotting观察损伤因子响应情况并探索RAD6B的底物,CCK8研究RAD6B敲除细胞对UV的敏感性,Hoechst染色从形态学观察细胞的凋亡。结果:1.免疫印迹实验结果显示,与阴性对照相比,感染LV-UBE2B-sgRNA(00485-1)病毒组细胞RAD6B表达明显降低(P0.01)。2.免疫荧光染色发现UV照射后XPC和γH2AX在细胞核内被招募。通过免疫印迹观察不同剂量和时间点γH2AX的表达,发现随着UV剂量增加,γH2AX表达增加,说明随着剂量加大细胞损伤程度也在增加,但UV剂量为15 J/m~2时,γH2AX表达最高。UV(15 J/m~2)照射后随着时间推移,γH2AX也在逐渐增加,2 h时间点γH2AX表达最高。通过免疫荧光检测sgCON和sgRAD6B两组细胞在UV照射后不同时间点CPD的表达,结果显示,两组细胞在UV照射后15 min均出现CPD募集,但与阴性对照细胞相比,RAD6B缺陷细胞在UV照射后18 h仍能检测到CPD表达。3.免疫荧光染色观察到MDC1、BRCA1、53BP1与损伤标记γH2AX在细胞核内共定位。免疫印迹结果显示,RAD6B敲除前后γH2AX与ERCC1在UV照射后均响应,并观察到ERCC1由胞质进入胞核修复损伤。随后我们采用免疫荧光技术检测细胞核内BRCA1和53BP1的表达,发现与对照组相比,RAD6B缺陷的细胞核中BRCA1和53BP1的foci形成明显减少(P0.01)。4.UV照射后,对照组细胞H2A的泛素化水平增加(P0.01),RAD6B缺陷细胞H2A泛素化水平下降(P0.05)。H2B在UV照射后出现了去泛素化(P0.01),但与对照组相比,RAD6B缺陷细胞H2B的泛素化没有明显差异。5.CCK8结果显示,敲除RAD6B降低了细胞存活。Hoechst染色结果显示,与对照组相比,RAD6B缺陷的细胞经UV处理后凋亡细胞增多。结论:1.RAD6B参与UV诱导的DNA损伤修复。2.UV诱导的DNA损伤修复通路中,γH2AX、ERCC1在RAD6B上游,募集RAD6B到DNA损伤部位,招募下游DNA损伤修复因子BRCA1和53BP1。3.在UV诱导的DNA损伤修复中,RAD6B可能通过泛素化组蛋白H2A、H2B以及H1.2参与损伤修复。4.RAD6B缺陷细胞对UV更加敏感,并且增加了UV诱导的凋亡发生。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R363
【图文】：

图 1.1 NER 通路图[28]DNA 损伤在促进细胞凋亡，衰老以及癌变方面发挥重要作用。研究表明细胞受到 DNA 损伤后，如果修复异常，就会导致基因突变诱发肿瘤形成。长接受紫外线照射可引发各种皮炎甚至诱发皮肤癌，因此，研究 DNA 损伤修复于预防肿瘤发生以及肿瘤治疗有很大的价值[29]。1.4 DNA 损伤修复与泛素化1.4.1 泛素与泛素化泛素（Ubiquitin）是一类在所有真核细胞中表达的高度保守的含有 76 个基酸残基的小分子蛋白质，靶蛋白可以通过泛素间的酶促反应而降解。泛素是指泛素分子在一系列特殊酶如泛素激活酶、交联酶、连接酶和降解酶等作下，对细胞中蛋白质分类，并选出相应的靶蛋白分子，进而特异性修饰靶蛋

学位论文 泛素交联酶 RAD6B 在 UV 诱导的 DNA 损伤修复中作因此，泛素系统作为近年来一个重要的研究成果，它已经成为[34]。（Ubiquitination）修饰是一个保守的多步骤过程。泛素激活 E2 和泛素连接酶 E3 三种酶参与其中（图 1.2）。第一步，下，泛素激活酶 E1 将泛素激活。第二步，泛素从泛素激活酶联酶 E2 活性位点半胱氨酸之间形成硫酯键。第三步，泛素泛素 Gly76 的羧基末端与底物中 Lys 的ε-氨基之间形成肽键而化。去泛素化酶（DUBs）从靶蛋白中去除泛素并将泛素再循]。E1、E2 和 E3 共同作用导致靶蛋白多泛素化，而泛素激活酶 E2 相互作用导致靶蛋白单泛素化。泛素化的结果就是靶向降解为较小的多肽、氨基酸等[36]。

24 3.2 RAD6B 参与 UV 诱导的 DNA 损伤修复。A 图为紫外线（UV）经 5 μm 孔径聚碳酸膜照射（60 J/m2）293T 细胞，免疫荧光进行 XPC 和γH2AX 染色。B 图为细胞经不同剂的紫外线照射，免疫印迹进行γH2AX 定量。C 图是对 B 图进行统计学分析。D 图为细胞紫外线（15 J/m2）照射后不同时间点通过免疫印迹进行γH2AX 定量。E 图是对 D 图进行计学分析。F 图为局部 UV 照射（60 J/m2）sgCON 细胞（上）和 sgRAD6B 细胞（下）同时间点后做免疫荧光进行 CPD 染色。（*P<0.05，**P<0.01）（放大倍数 40X）

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本文编号：2782996