一种简便、高效的从成人皮肤组织分离原代人体表皮干细胞的方法

发布时间：2020-08-08 09:05

【摘要】：目的:人体的表皮干细胞,又名人类角质形成细胞(HCKs),具有高分化潜能,能够增殖并分化出多种皮肤细胞,人们可利用此潜能进行临床疾病的再生治疗以及细胞学研究。而现阶段提取成人表皮干细胞的方法步骤较为繁琐,且提取的原代细胞数量有限,使其在后续的应用上受到限制。本研究旨在针对现阶段表皮干细胞提取方法存在的不足进行改良,并探讨其改良方案及改良后的提升效果。方法:将手术中切除的成人皮肤组织置于70%乙醇中30秒,清洗表面血块等杂物,并用剪刀对组织稍加修整。放入含有2%-3%青链霉素的PBS缓冲液进行简单的消毒,进一步清洗。共浸泡两次,每次3分钟,以达到灭菌消毒的目的。然后用手术刀将组织完全切碎成匀浆状态,将匀浆样组织转入50ml离心管中加入酶消化液(1g组织用20ml酶消化液,2.5mg/ml I型胶原酶和2.5mg/ml解离酶),混匀。将其放入37℃水浴锅内震荡消化60分钟。再加入0.25%的胰蛋白酶(1:5)到含组织的50ml离心管中继续消化30分钟;最后加入DNA酶I(10mg/ml)37℃消化5分钟。组织消化好后加相同体积的含有10%胎牛血清(FBS)的终止培养基反复吹打(大约20下)100μm细胞过滤器过滤,离心,弃上清,细胞沉淀用含10%胎牛血清的终止培养基重悬,离心;弃上清,所得的细胞沉淀用表皮培养基重悬,接种到细胞培养瓶或100mm细胞培养皿。培养皿里加入1:1000浓度为10mM的Rho关联蛋白激酶抑制剂Y-27632,培养2-3天。每2-3天换液。细胞密度生长至80%时进行传代、冻存或后续研究。同时,利用传统方法对相同皮肤组织进行细胞提取与培养:用10ml PBS冲洗,然后,用10ml 70%乙醇冲洗30秒,用10ml洗涤液(含2%青霉素和链霉素的PBS)浸泡两次,每次5分钟。用无菌剪刀修剪组织,在100mm细胞培养皿中去除皮下脂肪层,然后称重皮肤组织。将组织转移到另一个100mm无菌培养皿中,将真皮一侧朝下,然后用手术刀将皮肤组织切成3-4mm宽的条状。将2.5 mg/ml的解离酶液10 ml加到培养皿中,再置入皮肤组织,4℃孵育过夜。第二天,用镊子把真皮层上的表皮剥下来,用手术刀片将剥离下来的表皮切碎成匀浆状态,然后,用10ml 0.25%的胰蛋白酶在50ml的离心管中重悬,在37℃的水浴中震荡消化20分钟。通过加入等量的中和溶液来中和胰蛋白酶的活性。分离的表皮细胞悬浮液上下震荡20次,再用10ml移液管将细胞悬浮液通过100μm细胞过滤器,以去除任何残留的组织碎片。然后离心,重悬,清洗后再离心。用表皮细胞培养基将离心管底部的细胞团块重悬,移入培养皿进行培养。2-3天换液,细胞长满时传代。接下来,比较两种方法的耗时与复杂性,以及对所提细胞数量与质量的比较。我们将分别用两种方法培养的原代细胞于第3天、第5天进行观察,并比较第7天细胞数目上的不同,再将细胞培养至可传代的密度,分别记录所耗时间。另外,为了测定表皮干细胞的干性与纯度,我们将改良方法所获得的原代、第3代表皮干细胞进行细胞爬片,并在其生长至合适密度时对其进行K5、Loricrin、Veminten的免疫荧光染色。结果:(1)传统方法分离人体表皮干细胞时需经历一个过夜的酶消化过程,较为耗时,并且会影响细胞生命力。另外,由于需要将表皮从真皮上剥离,增加了方案的复杂性,还会损失部分表皮细胞。对于一些难以将表皮剥离的组织,这种方法的提取效率会大打折扣。而通过新方法的改良则省去了剥离表皮这一步骤,简化了提取过程,提高了效率。总时间约九十多分钟的酶消化过程也大大缩短了新方法的耗时,同时在一定程度上保证了细胞的生命力。(2)对于传统方法提取出的原代表皮干细胞,细胞生长速率较慢;而新方法利用了Y-27632增强表皮细胞功能的作用,使提取的角质形成细胞生长速率快且呈菌落式增殖。对新方法提取的原代细胞及传代后的细胞进行K5、loricrin、Vimentin免疫荧光染色,发现细胞的分化潜能高,维持了上皮基底细胞的特性。结论:体外培养的人体原代表皮干细胞已经被越来越多的应用于临床与科研领域。因此对于提取出的原代表皮干细胞的数量与质量有较高的要求,而传统提取成人原代细胞的方法不能很好的满足以上两个要求。本实验改进了现有方法的不足之处,缩短了酶消化时间,简化了细胞提取步骤,并利用Rho蛋白激酶抑制剂Y-27632提高原代角质形成细胞的增殖与贴壁,从而增加了细胞或的数量与细胞的干性。因此,本实验研究出的新方法可以获得高质量、足量的人体表皮干细胞,可以更好地应用于临床与科研领域。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2
【图文】：

操作步骤,表皮细胞

图２实验一改良方法提取原代表皮细胞操作步骤逡逑３０逡逑

密度,所需时间,细胞生长,状态

图４：实验二第３天、第５天细胞生长状态及到达传代密度所需时间逡逑３２逡逑

图５：实验二第７天原代细胞数目逡逑

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