应用“间接谱系转化”技术重编程小鼠胚胎成纤维细胞成为诱导性少突胶质细胞祖细胞的研究

发布时间：2020-08-08 03:50

【摘要】：“间接谱系转化”技术借助基因载体,通过表达转录因子,将已分化的体细胞重编程成为特定谱系的祖细胞,为再生医学提供了安全、高效的新途径。神经细胞轴突外的髓鞘对于神经系统的信号传导和脑内稳态的维持至关重要,髓鞘的缺失或功能障碍会导致众多疾病,例如多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)和脑白质营养不良。少突胶质细胞祖细胞(Oligodendrocyte precursor cells,OPCs)的移植是治疗髓鞘相关疾病的一种潜在方法。然而,体内OPCs在大脑中仅占约5-8%,且在成人脑中维持缓慢增殖或静止的状态。因此,在脑损伤后,通过OPCs分化成为少突胶质细胞(Oligodendrocytes,OLs)进而修复损伤髓鞘的能力十分有限。鉴于此,本研究通过过表达三种神经转录因子(Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10),将小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEFs)——NIH/3T3细胞重编程成为诱导性少突胶质细胞祖细胞(Induced oligodendrocyte precursor cells,iOPCs),其形态学和基因表达与原代OPCs相似,并具有体外分化的能力,为脱髓鞘疾病的细胞代替治疗、疾病模型构建和药物开发等奠定了基础。试验一:昆明小鼠原代OPCs的体外分离、培养和诱导分化小鼠OPCs是一种在体外极易受到损伤、不易存活的细胞。为了优化小鼠OPCs的体外分离培养体系,高效获得OPCs,并将其作为评估iOPCs质量的对照组,本研究通过探讨不同胎龄和消化方法对OPCs生长状况、细胞总数以及存活率的影响,筛选适宜条件,进一步优化OPCs的分离、纯化方案。结果表明:(1)采用0.125%胰蛋白酶结合0.25%鸡血清消化胎龄为18.5天小鼠胎儿脑皮质,所得的OPCs数量最多,与其余处理组之间均存在显著性差异(P0.05),且极显著性高于对照组(P0.01);(2)与1日龄新生小鼠相比,采用胎龄为18.5天的小鼠胎儿更容易分离得到OPCs,仅培养7-9天,细胞之间出现明显分层,且增殖速度较快,极大缩短了细胞培养时间;(3)无论是胎龄为18.5天的胎鼠还是1日龄新生小鼠,采用改良后的间隔震荡纯化方法纯化OPCs的存活率极显著性高于传统纯化方法(P0.01),且其纯度较高(97%);(4)分离所得OPCs能够在含有40 ng/mL三碘甲状腺氨酸(Triiodothyronine,T3)的无血清诱导培养液中分化成为OLs,在含10%胎牛血清的培养液中分化成为Ⅱ型星形胶质细胞,且体外分化所得细胞的纯度可达95%以上。因此,采用胎龄为18.5天的小鼠胎儿进行脑皮质的采集,经0.125%胰蛋白酶结合0.25%鸡血清消化15 min的方法可以获得具有典型形态、生长良好且具有体外定向诱导分化能力的OPCs。试验二:不同载体介导神经转录因子Olig 2质粒DNA转染NIH/3T3细胞的条件优化为了提高神经转录因子Olig 2质粒DNA转染NIH/3T3细胞的效率,为iOPCs的制备奠定基础,本研究分别采用不同浓度(2.5μg/mL、5μg/mL和7.5μg/mL)的非病毒转染载体(Lipofectamine 2000和Lipofectamine LTX)结合不同浓度(1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL和5μg/mL)的质粒DNA,且采用磁纳米颗粒载体与质粒DNA 1:1结合后转染NIH/3T3细胞,以绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因作为报告基因,通过比较不同处理组的转染效率和细胞毒性,筛选出转染效率高、细胞毒性小的转染条件。结果表明:三种试剂的最高转染效率处理组(7.5μg/mL Lipofectamine 2000结合3μg/mL质粒DNA处理组、7.5μg/mL Lipofectamine LTX结合2μg/mL质粒DNA处理组、2μg/mL Poly-MAG结合2μg/mL质粒DNA处理组)之间无显著性差异(P0.05)。但是,当三种试剂的转染效率达到最高时,Poly-MAG转染试剂对NIH/3T3细胞的毒性极显著性低于Lipofectamine 2000与Lipofectamine LTX转染试剂的细胞毒性(P0.01)。此外,由于磁性纳米颗粒载体Poly-MAG具有顺磁性,在外源性磁场的作用下,它能够快速地吸引至到细胞表面,有助于Olig 2质粒DNA的稳定表达。因此,宜采用2μg/mL Poly-MAG介导2μg/mL Olig 2质粒DNA转染NIH/3T3细胞。试验三:应用“间接谱系转化”技术重编程NIH/3T3细胞成为iOPCs的可行性研究为了建立NIH/3T3细胞向iOPCs的“间接谱系转化”体系,本试验采用磁性纳米颗粒载体Poly-MAG介导Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10转录因子在NIH/3T3细胞中过表达,并对重编程所得细胞进行形态学观察、免疫细胞化学染色、荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)以及Western Blot检测,旨在获得iOPCs,为髓鞘再生机制研究、药物筛选和细胞移植治疗等奠定基础。结果表明:重编程所得细胞具有以下特征:(1)具有OPCs的典型形态学特征,细胞呈圆形或椭圆形生长,折光性强,多数有两个突起,少数有三个突起,与小鼠原代OPCs十分类似;(2)表达OPCs特异性抗原——A2B5,A2B5~+细胞的数量占68.37±2.05%;(3)与对照组相比,重编程所得细胞的PDGFRα、S100β、NG2和Olig 2基因的表达量呈现出极显著性的上调(P0.01);(4)能够体外诱导分化成为MBP~+的OLs和GFAP~+的Ⅱ型星形胶质细胞,其阳性率分别为72.67?2.52%和75.36?1.98%;(5)与小鼠原代OPCs相比,iOPCs的A2B5蛋白水平差异不显著(P0.05),这说明过表达三个神经转录因子所得到的细胞与小鼠原代OPCs相似,有OPCs特异性蛋白A2B5的表达。因此,采用Poly-MAG介导Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10的过表达能够将已分化的NIH/3T3细胞重编程成为iOPCs。结论:宜采用0.125%胰蛋白酶结合0.25%鸡血清消化18.5天胎龄昆明小鼠胚胎的脑皮质,混合培养7-9天后细胞出现明显分层,通过间隔震荡纯化方法,可以高效获得形态正常、增殖较快且具有分化能力的OPCs;在外源性磁场的作用下,采用2μg/mL Poly-MAG结合2μg/mL Olig 2质粒DNA能够更为高效地转染NIH/3T3细胞,且细胞毒性较低;利用该磁性纳米颗粒转染体系介导三个神经转录因子Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10的过表达能够将NIH/3T3细胞重编程成为iOPCs,为脱髓鞘机制的研究和相关疾病的治疗等提供了丰富的细胞资源。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2
【图文】：

谱系,重编程,策略,谱系

直接谱系转化技术是将已分化的细胞直接转化为另一种类型的细功能性细胞的增殖能力有限，经移植到体内后，该类细胞很难进一无法达到治疗的目的，同时，如果移植大量的细胞，又将增加免疫而，间接谱系转化技术是将已分化的细胞转化为特定谱系的祖细与功能化细胞相比具有更强的增殖能力，且能够在体内分化成为特，既避免了伦理争议又简化了流程，极大地减少了自发性突变和体确定的发生概率，降低了出现癌变的风险[4, 20]，为细胞再生治疗提安全、高效的新策略。 iOPCs 生成策略的研究进展，多种细胞例如 MEFs[21]、人子宫内膜基质细胞（ Hrial-derived stromal cells，hEnSCs）[22]、人诱导性多能干细胞（Human int stem cells，hiPSCs）[23]、神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）[2成 iOPCs 的细胞启动源（图 1）。为提高 iOPCs 的生成效率和安全性子、miRNA、小分子物质和载体等被用于优化 iOPCs 的生成策略。

胰蛋白酶,体外分离,培养效果,胎鼠

且细胞密度大，生长状态良好（图 2B、图 3B）；0.125 %胰蛋白酶结合 4 %鸡血清处理组（图2D、图 3D）或 0.25 %胰蛋白酶结合 4 %鸡血清处理组（图 2H、图 3H）所得 OPCs的数量少于单独使用 0.125 %胰蛋白酶处理组（图 2A、图 3A）或 0.25 %胰蛋白

胰蛋白酶,体外分离,新生小鼠,培养效果

图 3 不同浓度的胰蛋白酶和鸡血清对 1 日龄新生小鼠 OPCs 体外分离、培养效果的影响A. 0.125 %胰蛋白酶；B. 0.125 %胰蛋白酶+0.25 %鸡血清；C. 0.125 %胰蛋白酶+1%鸡血清；D. 0.125 %胰蛋白酶+4 %鸡血清；E. 0.25 %胰蛋白酶；F. 0.25 %胰蛋白酶+0.25 %鸡血清；G. 0.25 %胰蛋白酶+1%鸡血清；H. 0.25 %胰蛋白酶+4 %鸡血清；I. 对照组：机械吹打。标尺=25 m。Fig. 3 Effects of different concentrations of trypsin and chicken serumon isolation and culture of Kunming mouse OPCs in vitroA. 0.125 % trypsin; B. 0.125 % trypsin + 0.25 % chicken serum; C. 0.125 % trypsin + 1 % chicken serum; D. 0.125trypsin + 4 % chicken serum; E. 0.25 % trypsin; F. 0.25 % trypsin + 0.25 % chicken serum; G. 0.25 % trypsin + 1 %chicken serum; H. 0.25 % trypsin +4 % chicken serum; I. Control group: mechanical isolation group. Bar=25 m.3.1.2 细胞总数采用表 6 所示不同消化方法分别处理胎龄为 18.5 天的胎鼠和 1 日龄小鼠的脑皮质，培养 7-9 天后，对分层细胞进行纯化，统计每个处理组所得 OPCs 的细胞总数（图 4）。结果表明：0.125 %胰蛋白酶结合 0.25 %鸡血清处理组（第 2 组）所得 OPCs 数量最多，与对照组（第 9 组）相比差异极显著（1.34±0.94×106个/m

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