Galectin-10突变体结构与活性的研究

发布时间：2020-08-08 00:30

【摘要】：半乳糖凝集素(Galectins)是凝集素家族中一类较为经典的半乳糖结合蛋白,结构中包含对β-半乳糖苷具有特殊亲和力的1至2个糖基识别结构域,该结构域约由140个氨基酸构成,识别程度较高且氨基酸序列高度保守。Galectins在许多方面都发挥着重要的生理功能,例如生长调节,细胞粘附,细胞凋亡,免疫反应等过程,并且在治疗某些疾病中也起到了关键的作用。其中的Galectin-10(Gal-10)是半乳糖凝集素家族中的一种原型半乳糖凝集素,只含有单个糖基识别结构域,主要以同源二聚体形式存在,大多分布于嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞中。在体内可以特征性地形成双锥体六角形晶体,又被称为Charcot-Leyden晶体蛋白(CLC)。嗜酸性粒细胞存在于呼吸道,淋巴结,脾脏等多种组织,与各种疾病相关,包括哮喘,过敏性鼻炎,急性髓性白血病(Acute Myelogenous Leukemia,AML)等。自Galectin-10被发现以来,已有160多年的历史,其可在人体内自发形成蛋白质晶体。Galectin-10的三维晶体结构虽已被解析出来,但是目前的结果显示Galectin-10不能结合乳糖,原因尚未完全清楚。本文的研究思路通过突变Galectin-10野生型糖识别结构域的关键位点,重点分析突变体结构与活性之间的关系,从突变体的二聚化水平,晶体的结构解析,蛋白活性以及在细胞中的分布等方面进行研究,可为相关疾病的治疗带来新的思路和方向。本文具体的研究内容、方法以及研究成果介绍如下:首先通过阅读已发表的文献并分析结构,确定Galectin-10野生型的关键氨基酸位点,然后分别进行点突变,合成获得5个重组质粒,在大肠杆菌中独立表达。利用Ni-NTA亲和层析的方法进行提取、纯化,得到纯度较高的蛋白质。将得到的Galectin-10野生型及5个突变蛋白分别进行结晶,通过坐滴法筛选适合晶体生长的条件,然后通过悬滴法对溶液浓度、pH等晶体条件进行优化以得到形态规则的晶体。通过比较Galectin-10突变体的结构与野生型蛋白结构之间的区别,解析突变体与乳糖共结晶的结构,进而分析这些突变体对乳糖的结合能力和对蛋白质二聚化的影响。结果显示突变体E33A能够微弱地结合乳糖,而其他蛋白不能。通过蛋白质分子筛层析实验研究这些Galectin-10突变体的多聚体形式,结果显示突变体W127A为单体结构,说明了127位色氨酸(Trp127)是Galectin-10形成二聚化的关键氨基酸。此外,红细胞凝集实验,糖阻抑实验以及乳糖胶亲和层析实验用于补充研究Galectin-10野生型及突变体的相关活性。在红细胞凝集实验中,突变体W127A表现出比野生型Galectin-10及其他突变体更高的血细胞凝集活性。在红细胞凝集糖阻抑实验中,突变体E33A对乳糖敏感,而其他突变体不敏感。另外,突变体W127A可与乳糖胶结合,这表明W127A单体的开放碳水化合物结合位点可以与乳糖结合。嗜酸性粒细胞的免疫荧光显微镜检查显示,在细胞核中有相当数量的Galectin-10浓缩颗粒。本论文中选择带有绿色荧光标签的pEGFP-N1作为表达载体,利用分子克隆技术成功构建重组质粒。同时利用细胞生物学的技术手段,包括细胞传代培养,细胞转染,细胞核荧光染色等操作将重组质粒转入宫颈癌细胞(HeLa细胞)中,观察其分布和表达。结果显示,EGFP标记的Galectin-10野生型及各突变体均匀地分布在HeLa细胞的细胞核内,表明Galectin-10可能在细胞核中进行动态交换,而突变体W72A分布在细胞质中,无法进入细胞核,猜测Trp72对于Galectin-10转运到细胞核中是至关重要的。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R363
【图文】：

图 1-1 动物凝集素的细胞分布、活性及免疫组分[9]1.1.3 凝集素的结构和活性凝集素是由两种类型的亚基组成的寡聚体，每个都通过疏水区插入细胞膜中，并碳水化合物的结合结构域位于细胞外。细胞可以通过表面的碳水化合物与凝集素相互用，也可以通过与细胞表面凝集素结合的可溶性糖蛋白形成的桥相互作用，或者可以促进细胞-基质粘附的细胞外基质中不溶性组分的碳水化合物结合（图 1-2）[12]。

图 1-1 动物凝集素的细胞分布、活性及免疫组分[9]的结构和活性由两种类型的亚基组成的寡聚体，每个都通过疏水区插结合结构域位于细胞外。细胞可以通过表面的碳水化合过与细胞表面凝集素结合的可溶性糖蛋白形成的桥相互质粘附的细胞外基质中不溶性组分的碳水化合物结合（

上可以作为研究细胞膜结构的探针[16]，尤其是并可以在一定程度上抑制肿瘤细胞的生长繁殖。为免疫防御功能的重要体液因子之一，具有多酶、荧光素、铁蛋白、生物素等物质结合的同光镜和电镜水平的免疫细胞化学研究工作中有化，癌变等生物学演变过程以及对肿瘤的诊断素家族中较为重要的成员，结构上都具有 1至 2苷展现出特殊的亲和力[18]。该结构域约由 140个 β折叠和无规则卷曲的结构[19]，如 Galectin-1的成夹层结构（图 1-3）[20]。

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本文编号：2784755