海南捕鸟蛛毒素激活中电导钙激活钾通道的分子机制

发布时间：2020-08-07 20:46

【摘要】：IK通道是由钙离子和电压双向门控的钾离子通道,广泛分布在机体多种类型细胞中,如T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞和肌细胞等。同时IK通道与细胞生理活动的调控密切相关,如细胞数目增殖、细胞迁徙、细胞凋亡焦亡以及基因控制的细胞程序性死亡等。目前研究发现IK通道与恶性肿瘤、气道重塑、心肌梗死、动脉粥样硬化、哮喘、肾纤维化、镰刀形红细胞病等多种疾病密切相关。海南捕鸟蛛毒素-I(HNTX-I)是从海南捕鸟蛛中分离得到的一种高丰度多肽,相对分子量为3608.1 Da,含有33个氨基酸残基,其序列为ECKGFGKSCVPGKNECCSGYACNSRDKWCKVLL。虽然HNTX-I是至今为止发现的第一个IK通道的多肽类激活剂,但其活性并不理想,而且HNTX-I毒素与IK通道的相互作用机制也并不清楚。为了解决上述问题,深入研究HNTX-I毒素与IK通道作用的分子机制,本实验合成HNTX-I及其11条突变体,分别为E1K、E1F、E1F-S18K、K3A、F5I、K7A、E15D、R25A、D26A、K27A、K30A。通过膜片钳实验验证发现,合成的HNTX-I的活性和天然的HNTX-I的活性一致,表明合成后复性的多肽与天然的HNTX-I的结构相同。在HNTX-I的一系列突变体中,K3A、F5I和K7A在40μM浓度下对IK通道无明显的激活作用,E1F、E1F-S18K和E1K对IK通道的激活率在40μM浓度下均高于HNTX-I的激活率。E1F对IK通道的活性最高,4μM的E1F激活率为20.1%±0.4%,40μM的E1F激活率为78.5%±0.5%,80μM的E1F激活率为112.5%±0.7%,经Boltzmann sigmoidal方程拟合E1F对IK通道激活的EC_(50)为8.01μM。上述结果表明,HNTX-I上的第1、3、5、7位氨基酸残基可能是毒素结合IK通道的关键位点,毒素主要利用N端氨基酸作用于IK通道。选取活性最高的HNTX-I突变体E1F研究HNTX-I与IK通道的结合机制。首先加入80μM的E1F后IK电流被显著激活,再加入100nM NS309继续能够激活IK通道电流大约1.25倍,加入1μM的TRAM-34能显著抑制IK被激活的电流。为了进一步探讨毒素与通道之间作用的结合机制,利用定点突变的方法对IK通道S1-S2、S3-S4、S5-S6的胞外区域进行丙氨酸扫描,构建了一系列IK通道突变体。在40μM浓度下,E1F对IK通道突变体W141A和T260A无明显的激活作用,但是对G259A的激活程度明显增强,说明这三个位点区域是毒素与通道作用的关键位置。S5-S6区域的Q229、V231、N232、T234、S238等突变后也显著的降低了和HNTX-I的亲和力。靠近S6的G259突变后可能由于疏水性减弱使E1F对IK通道的亲和力明显增强,相反T260突变后可能由于极性增强使相互作用力减弱。以上结果表明,HNTX-I毒素与IK通道相互作用可能是疏水作用的结果。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R363
【图文】：

示意图,二级结构,通道,示意图

紧邻 S6 亚基跨膜螺旋的 C 末端是该通道的关键区域，其内部位点可以与钙调蛋白- Ca2+复合物结合，从而使通道开放，K+IK 通道主要由 Ca2+调节，和电压无直接关系[51]。通道是由 Ca2+浓度和电压双向门控的钾离子通道，广泛存在人并参与调控细胞生理活动，如细胞数目变化、细胞迁移、细胞凋控制的细胞程序性死亡等等[52]。目前研究发现，它与多种疾病胞瘤细胞（GBM）的迁移和侵袭。由于它严重依赖于 Ca2+信号中存在多种物质，能够激活三磷酸肌醇信号通路，该通路通过RAC 通道促使 Ca2+从胞外流向胞内。同时，胞内的内质网也会此时，胞内的 Ca2+浓度升高激活 IK 通道，该通道在 GBM 细胞，由此促使 K+向胞外流动，细胞膜高度极化促使肿瘤细胞迁移IK 通道与恶性肿瘤、气道重塑、心肌梗死、动脉粥样硬化、哮镰刀形红细胞病等多种疾病密切相关[54-57]。

二聚物,开闭,C端,机理

图 1-3 Ca2+诱导的 IK 通道 C 端二聚物开闭的作用机理[59]圆二色谱（CD 谱）法圆偏振光是在交变电流存在的环境下，石英晶体产生结构变化导致在电场两生的光波。圆二色谱(CD 谱)是平面偏振辐射的左右圆偏振光分量的微分吸。也就是说，左右圆偏振光经过固有手性或置于手性环境中的色团时，产生振光的振幅差。根据不同波长下光谱振幅差所反映的信息，我们可以做大致。当左右圆偏振光经过样品时，如果样品中没有生色团，那么穿过样品后光偏振幅度不会变化，还在原平面上；反之，光波偏振振幅将会改变。不同的团会使光波偏振振幅差差异很大。CD 光谱学是一种测量物质结构的手段，一种很好的研究结构生物学的工具[61]。除此之外，常用的检测物质结构的方有 X 射线晶体学、NMR 波谱学、低温电子显微镜等等。

高效液相色谱,色谱分析,色谱质谱,峰时间

硕士学位论文 HNTX-I 活性检测体积等浓度（100 μL, 2 mg/mL）合成的 HNTX-I 和天例混合，同样借助于分析型Waters2695高效液相色谱系 HPLC 结果显示在乙腈浓度大约为 37%、25 min 左峰时间完全一致，峰形、峰面积完全重合，表明两者质谱验证分子量也与理论值相符合。根据色谱质谱结-I 与天然的 HNTX-I 的构象可能是一致的。

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